丹參凝集素促進血管平滑肌細胞的增殖機制研究*

沈艷花，牛成群，覃韋寧，李 珊，武福云

(湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北十堰 442000)

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)位于血管中膜，是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞，并且在多種生理過程中發揮重要作用。VSMCs的增殖分化與血管發育、血管損傷修復和血管重塑等密切相關[1]。而異常的VSMCs增殖可造成許多病理性損傷，如動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄和高血壓血管重塑等心血管疾病[2-4]。中草藥在治療心血管疾病方面具有獨特的優勢，如益氣活血化瘀的中藥丹參[5]。丹參的主要提取物包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸類[6]。以往研究表明，丹參酮能夠抑制VSMCs增殖，具有抗動脈粥樣硬化的作用，而丹酚酸對VSMCs及內皮細胞具有保護作用[7-8]。除此之外，中草藥活性蛋白在心血管疾病方面的作用也得到了重視，但是如何保證分離純化蛋白的純度及活性至關重要[9]。利用蛋白質純化及質譜鑒定技術筆者得到了具有生物活性的丹參凝集素蛋白(SMLP)，并研究了其對大鼠VSMCs增殖的影響，以及利用丹參基因組已經測序這一優勢，獲得丹參凝集素基因，并利用蛋白質原核表達系統在體外表達純化有功能的SMLP，為進一步研究丹參凝集素的功能、其促進VSMCs增殖的機制及在其他領域的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料 中藥丹參購自藥店，并經湖北醫藥學院鑒定。大鼠VSMCs A7r5購自上海慧穎生物科技有限公司，抗體購自武漢三鷹生物技術公司。分子克隆相關試劑：DNA聚合酶、限制性內切酶及T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa公司，感受態細胞Trans I-TI、BL21購自全式金生物技術公司。蛋白表達相關試劑：LB培養基、卡那霉素、誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工。蛋白純化相關試劑：鎳柱(Ni NTA beads)、陰離子交換柱及分子篩購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1丹參蛋白的提取分離 丹參藥材經粉碎后，按照1∶5(g/mL)加入磷酸鹽緩沖液(PBS)，4 ℃浸泡24 h后，4 ℃，5 000×g離心10 min后將上清液轉移到濃縮管，濃縮后，經分子篩superdex 200分離，并利用陰離子交換柱進一步分離得到目的蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測分離純化后的蛋白，并用于后續的質譜鑒定。

1.2.2噻唑藍(MTT)實驗 以3 000個/孔的細胞密度將A7r5細胞接種于96孔板，設置3個復孔。培養箱培養12 h，使細胞貼壁。實驗組每孔加入不同濃度的丹參凝集素蛋白，繼續培養24 h，每孔加10 μL的MTT(5 g/L)繼續培養4 h，棄上清液，加150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩5 min，使MTT結晶完全溶解，以空白對照孔調零，酶聯免疫檢測分析儀測定490 mm處的吸光度值(A值)，各復孔A值的平均值作為統計數據，所檢測的A值的大小可反映活細胞數量。MTT實驗至少重復3次。

1.2.3免疫印跡法(Western blot) 對照組和SMLP處理組細胞用RAPA裂解液裂解后，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度，利用SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%奶粉封閉1 h后，加入一抗4 ℃孵育過夜，Tris緩沖鹽-吐溫溶液(TBST)洗膜后，二抗孵育2 h，顯色。

1.2.4pet-28a-sml原核表達載體構建 以丹參為材料，抽提其葉片總RNA，利用反轉錄PCR(RT-PCR)的方法得到其cDNA第一鏈。以cDNA為模板，通過PCR的方法體外擴增出丹參凝集素基因sml，通過NheI和XhoI限制性內切酶及T4 DNA連接酶將sml基因插入到原核表達載體pet-28a，轉化感受態細胞DH5α，提質粒送武漢擎科生物公司測序，確認序列正確，引物合成及質粒測序由武漢擎科生物公司完成。所用上下游引物中正向：5′-CTA GCT AGC ATG GCC AAC CTT CCC CAA AC-3′；反向：5′- CCG CTC GAG TCA AAT CTG CTT AAG GCT GAC-3′。

1.2.5蛋白表達及純化 取測序正確的pet-28a-sml質粒轉化表達蛋白的感受態細胞BL21，將菌接種到LB培養基，并加入卡那霉素(50 μg/mL)，37 ℃振蕩培養至A值達到0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，24 ℃誘導12 h后，5 000 r/min離心15 min收集菌體，超聲破碎后12 000×g離心30 min，收集上清液與鎳柱結合，Wash buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)洗掉非特異結合的蛋白，Elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑)將凝集素蛋白從鎳柱上洗脫下來，經離子交換柱進一步純化后，濃縮到5 mg/mL，并過濾除菌，用于后續細胞實驗或冷凍于-80 ℃保存。

1.2.6紅細胞凝集實驗 制備2%小鼠紅細胞懸液，吸取少許滴兩滴到干凈的玻片上，分別加入PBS和0.6 μmol/L SMLP，2 min后觀察紅細胞凝集的結果。

2 結 果

2.1丹參活性蛋白的分離 將中藥丹參粉碎后，用PBS浸提丹參蛋白后，將總蛋白經過分子篩分離，得到3個主要的組分P1、P2和P3。將這3個組分經SDS-PAGE分離后，得到了一個相對分子質量25×103左右，并且含量較多的蛋白，見圖1A。為進一步純化該蛋白，將P1組分繼續通過陰離子交換柱，得到了純化的丹參蛋白，見圖1B。

A：分子篩分離丹參蛋白電泳分析；B：陰離子交換柱分離蛋白電泳分析

圖1 丹參蛋白的分離純化及電泳分析

2.2丹參活性蛋白的鑒定 采用質譜鑒定純化的丹參活性蛋白，并與丹參基因組數據庫比對得到該蛋白的氨基酸序列，見圖2A。使用美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫的Blast功能進行蛋白質序列比對，得出該蛋白是一種L型的植物凝集素，將該蛋白稱為SMLP。

2.3SMLP素促進VSMCs增殖 為檢測SMLP對VSMCs的增殖作用，將從丹參中分離純化的SMLP加入到A7r5細胞培養液中，處理24 h后，利用MTT實驗檢測細胞的增殖率。結果表明，SMLP能夠明顯促進VSMCs的增殖，見圖3A。為進一步確認SMLP對A7r5細胞的促增殖作用，利用Western blot檢測增殖相關基因蛋白激酶B(AKT)基因與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)總蛋白表達水平，以及二者的磷酸化水平，見圖3B；同時，檢測凋亡相關基因JNK1和Bax，見圖3C。結果表明，SMLP能夠促進ATK及mTOR的磷酸化，磷酸化AKT(p-AKT)和磷酸化mTOR(p-mTOR)水平升高，總ATK及mTOR未發生明顯變化，而相關凋亡基因的表達水平被抑制。

A：丹參活性蛋白的氨基酸序列；B：蛋白質序列比對

圖2 丹參活性蛋白質譜鑒定

A：MTT實驗檢測SMLP對A7r5細胞的增殖作用；B：不同濃度SMLP處理細胞后AKT、mTOR及其磷酸化水平；不同濃度SMLP處理細胞后凋亡相關基因JNK1和Bax的變化水平；*：P<0.05，#：P<0.01

圖3 SMLP促進VSMCs增殖

A：PCR擴增丹參凝集素基因sml；B：雙酶切驗證sml基因插入到原核表達載體pet-28a；泳道1：未經酶切的重組質粒；泳道2：酶切之后的重組質粒；C：體外表達純化SMLP；M：蛋白標志物

圖4 SMLP的原核表達載體構建及蛋白表達純化

2.4SMLP的原核載體構建及蛋白表達純化 丹參是首個基因組測序的中草藥，利用這一優勢，構建了丹參凝集素基因的原核表達載體。通過PCR的方法體外擴增出丹參凝集素基因sml，見圖4A；通過酶切連接的方法將sml基因插入到原核表達載體pet28a，經雙酶切驗證，成功構建了pet28a-sml載體，見圖4B；經測序確認序列正確后，將其轉化至感受態細胞BL21，誘導表達帶有His標簽的SMLP，純化后得到了高純度的SMLP，見圖4C。

2.5SMLP活性檢測 為分析體外表達純化的丹參凝集素蛋白是否具有功能，檢測其凝集紅細胞的功能。結果顯示，左側紅細胞懸液加入PBS，紅細胞均勻分散，并無凝集；右側紅細胞懸液加入純化的凝集素蛋白SMLP，紅細胞凝集成塊，顏色加深，見圖5。

圖5 SMLP血細胞凝集實驗

3 討 論

目前，中草藥小分子化合物的分離鑒定取得了很大的進展，多種小分子被應用于抗腫瘤及心血管疾病的治療，包括生物堿類、甙類、酮類、萜類和揮發油類等[10]。但是，中草藥中除了這些重要的次生代謝產物外，還存在很多活性蛋白，它們的重要性往往被忽視。主要原因是從中草藥中提純蛋白質有一定的難度。如何在提取過程中保證蛋白質的純度及活性非常關鍵。并且，由于大多數中草藥基因組尚未測序，很難得到確切的蛋白序列并了解其功能，也很難利用一些基因工程技術手段大量地表達這些蛋白，影響了其應用價值。

丹參作為常用的活血化瘀藥物，在治療心血管疾病方面具有重要的作用。丹參含有多種化學成分，具有多種藥理活性。目前，從丹參中分離的化學成分達100多種，有效成分主要包括脂溶性的丹參酮類和水溶性的酚酸類。多項研究表明，丹參酮類具有改善缺血、抑制心肌肥厚、抗動脈粥樣硬化及抑制血小板聚集等功能。而丹酚酸類則具有活血通絡的作用，常用于心腦血管疾病的治療[11]。丹參小分子的分離鑒定及藥理作用研究取得了很大的進展，但在活性蛋白研究方面仍存在不足。丹參作為第一個基因組測序的中草藥，研究其活性蛋白有很大的優勢。因此，筆者選擇丹參作為研究對象，分離純化及鑒定其有功能的蛋白。本研究分離并純化得到一個相對分子質量約為25×103的蛋白，通過MTT實驗及Western blot檢測發現，該蛋白能夠明顯促進大鼠VSMCs增殖。通過質譜鑒定得到其氨基酸序列，經蛋白BLAST比對證明，該蛋白是L型的植物凝集素。根據丹參基因組序列，得到了丹參凝集素基因sml的DNA序列，利用分子克隆及蛋白表達純化技術，得到大量高純度的SMLP，并利用紅細胞凝集實驗證明體外表達純化的SMLP具有紅細胞凝集的功能。

通過本研究證明，SMLP能夠促進大鼠VSMCs增殖，其可能通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路。VSMCs的增殖受多種生長刺激因子和抑制因子的雙重調節。它們通過多種信號轉導通路參與VSMCs的増殖及凋亡，其中PI3K-AKT信號通路被證明是非常重要的一條通路[12-14]。AKT蛋白在各種組織中廣泛表達，如在心臟、肝臟、腎臟和骨骼肌等組織中表達，主要通過上游的PI3K磷酸化被激活，并調節下游的多個靶基因，如mTOR、核因子-κB(NF-κB)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和FKHR等，進而調節細胞的增殖、分化、調亡及遷移等[15]。本研究結果表明，SMLP能夠促進VSMCs AKT和mTOR蛋白的磷酸化，并且能夠抑制相關凋亡蛋白水平，從而促進其增殖。但SMLP能否促進其他細胞的增殖，以及是否還會通過其他信號通路，仍需進一步研究。

VSMCs是唯一能通過遷移、增殖和合成細胞外基質來修復受損血管壁的血管細胞，是構成血管中膜并執行相應生理功能的物質基礎，具有保持血管完整性和維持血管張力的作用。SMLP能夠促進其增殖，這對于VSMCs發揮正常生理功能具有重要意義。但在病理過程中，VSMCs功能障礙與疾病的發生、發展密切相關。VSMCs通過自身增殖、遷移及合成細胞外基質參與高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等多種血管疾病的病理過程[16-18]。因此，闡明VSMCs增殖的調節機制，對于理解心血管疾病的發病過程及臨床治療非常關鍵。本研究初步發現SMLP能夠促進VSMCs增殖，下一步通過體外蛋白質相互作用方法pull-down等，可以找到與SMLP相互作用的細胞表面受體，以及其激活的增殖相關的信號通路，將進一步揭示VSMCs增殖的機制，對于理解心血管疾病的發病機制有重要意義。除此之外，植物凝集素具有多種重要的功能，如凝集紅細胞、參與植物的防御反應及促進淋巴細胞的分裂等，而且植物凝集素被廣泛地應用于靶向性藥物載體[19-20]。目前多種植物凝集素被分離鑒定，但是只能利用傳統的蛋白質分離辦法，其純度及活性都很難得到保證。丹參的全基因組已經測序，這對于研究其功能蛋白就簡單了很多，利用基因工程技術，可以很容易地獲得高純度并且具有活性的SMLP，這對于后續研究其功能、藥物開發及應用于多個領域都非常重要。