腦梗死過程中微RNA-181d和腫瘤壞死因子α的表達及機制研究*

單海雷，焦光美，竇志杰，馬 征，張曉璇，楊 寧，高燕軍

(承德醫學院附屬醫院神經內科，河北承德 067000)

腦梗死是世界范圍內人群死亡的主要原因之一，也是導致長期神經功能損傷的主要原因。多重因素導致的疾病復雜性阻礙腦梗死的診斷和治療[1]。雖然已開展許多有關腦梗死治療的臨床試驗，但目前血栓溶解仍是主要治療方法[2]。因此，迫切需要開發新的有效的診斷和治療方法。微RNAs(microRNAs，miRNAs)是生物體內廣泛存在的含19～24個核苷酸的非編碼RNA，其可與靶基因mRNA的3′非翻譯區域(3′UTR)結合，阻止它們的翻譯。miRNAs可調節多種細胞活動，如細胞增殖、分化、凋亡、器官發育、機體代謝和腫瘤發生。且近年來，許多研究已經注意到miRNAs在腦梗死中的作用。腦缺血后，大腦中miRNAs的表達發生改變[3]。另外，有些miRNA在人體血清或血漿中穩定存在，可以作為組織損傷和病理狀態的特異標志物[4]。研究發現，miR-181家族中，miR-181a對小鼠的缺血性神經損傷具有保護作用[5]，下調的miR-181b通過對熱休克蛋白A5(HSPA5)和UCHL1蛋白水平的負調控，誘導神經保護對抗缺血性損傷，為缺血性腦卒中提供了一個潛在的治療靶點[6]。缺血后miR-181c直接作用于腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，從而調節小膠質激活和小神經膠質細胞介導的神經元損傷[7]。然而，miR-181家族的第4個重要成員miR-181d在腦缺血中的作用還鮮有報道。本研究旨在通過檢測腦梗死患者和大腦中動脈阻塞(MCAO)模型小鼠血清中miR-181d的表達水平及其與炎癥的關系，初步揭示miR-181d在腦梗死中的作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清標本 采用回顧性研究方法，收集32例發病48 h內入住承德醫學院附屬醫院的腦梗死患者血清(腦梗死損傷組)，其中男21例，女11例，年齡34～73歲，平均(54.0±18.7)歲。另選取體檢正常的健康對照人群13例收集血清(對照組)，男9例，女4例，年齡38～69歲，平均(53.0±14.7)歲。所有患者采血前均未進行過擴容、擴血管及溶栓治療，無創傷及手術史；并且除外其他癌癥、感染或免疫疾病患者。兩組性別、年齡及高血壓、糖尿病、高血脂等并發癥比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合醫學倫理學標準，獲得患者或家屬的知情同意，同時經本院倫理委員會批準。

1.1.2小鼠MCAO模型 C57BL/6雄性小鼠，體質量為20～25 g，于22～24 ℃正常晝夜交替環境飼養。稱重后，按70 mL/kg腹腔注射5%水合氯醛。參照Longa線栓法建立小鼠左側MCAO模型。36只小鼠分為假手術組(n=6)和腦梗死組(n=30)。腦梗死組于梗死后1、3、7、14、28 d取材。

1.2方法

1.2.1血樣采集和血清總RNA提取 收集腦梗死患者發病48 h內的靜脈血5 mL，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，4 ℃冰箱靜置30 min，3 000 r/min離心30 min，取上層血清置于無RNA酶離心管中，然后按照血清miRNA提取試劑盒說明書(北京天根生化科技有限公司)提取血清總RNA。

1.2.2細胞培養 THP-1細胞購自美國ATCC公司。人胚腎HEK-293T細胞系購自CBTCCCAS。這些細胞均用DMEM培養基[含10%胎牛血清(FBS，購自美國Invitrogen公司上海分公司)]于37 ℃、含5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.3實時定量反轉錄PCR(qRT-PCR) 從血清中提取的總RNA用TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit(美國Applied biosystem公司)和miR-181d特異性反轉錄引物反轉錄成特異性產物。然后使用TaqMan miR-181d探針(美國Applied biosystem公司)在IQ5實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行qRT-PCR。整個反應體系嚴格按照說明書進行。

1.2.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 使用Abcam公司試劑盒(人TNF-α ELISA試劑盒ab46087；小鼠TNF-α ELISA試劑盒ab208348)檢測。使用每個樣品的3個平行樣進行統計分析。

1.2.5報告基因質粒構建 包含miR-181d潛在結合位點的人TNF-α 3′-UTR序列是通過PCR擴增獲得，以HEK-293T細胞的DNA為模板。突變質粒采用上海碧云天生物技術有限公司的快速突變系統生成。PCR產物通過SgfI和PmeI位點連接到psiCHECK-2載體上(美國Promega公司)。插入片段的序列通過DNA測序證實。所用引物：TNF-α-3′-UTR-WT-正向：5′-GAC CGC GAT CGC CCA CTA AGA ATT CAA ACT G-3′；TNF-α-3′-UTR-WT-反向：5′-CTT AGT TTA AAC CGA TTA CAG ACA CAA CT-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-正向：5′-TTT ATT ATT TAT TTA TTT ACA GAA CTT ACA ATT TAT TTG-3′；TNF-α-3′-UTR-Mut-反向：5′-CAA ATA AAT TGT AAG TTC TGT AAA TAA ATA AAT AAT AAA -3′。

1.2.6熒光素酶報告基因檢測實驗 將含TNF-α 3′-UTR或其突變體的報告基因載體的psiChECK-2質粒和miR-181d或對照模擬物一起，使用脂質體2000試劑(美國Invitrogen公司)瞬時轉染到HEK-293T細胞中。48 h后，用被動裂解緩沖液100 μL(美國Promega公司)裂解細胞，然后按照Promega雙熒光素酶報告系統試劑盒說明書(美國Promega公司)檢測裂解液的熒光素酶表達水平(體系：20 μL；使用貝特霍爾德FB12光度計測量)。內參為海腎熒光素酶。

1.2.7蛋白質印跡法(Western blot) 細胞吸去上層細胞培養基后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，然后加入RIPA裂解液，98 ℃變性10 min；用制備好的10%丙烯酰胺(SDS)膠板電泳(90 V電壓)；用硝酸纖維素膜轉膜過夜(100 V，4 ℃)；脫脂牛奶常溫封閉2 h；用含2%牛奶的PBS配置一抗過夜孵育;1‰ TBST洗膜3遍，每遍10 min，用含2%牛奶的PBS配置二抗，和膜室溫孵育2 h；再用1‰ TBST清洗膜3遍，每遍15 min。加入辣根過氧化物酶底物，反應2 min，用上海勤翔ChemiScope 6000化學發光系統曝光。

A：血清miR-181d表達水平比較；B：血清TNF-α表達水平比較；C：miR-181d和TNFα表達水平的相關性分析

圖1 腦梗死組與對照組血清miR-181d和TNF-α的表達及相關性分析

A：血清miR-181d表達水平比較；B：血清TNF-α表達水平比較；C：小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α表達水平的相關性分析；*：P<0.01，與假手術組比較

圖2 小鼠MCAO模型血清miR-181d和TNF-α的表達和相關性分析

2 結 果

2.1miR-181d、TNF-α在腦梗死損傷組與對照組血清的表達變化及相關性 腦梗死損傷組患者血清miR-181d表達水平低于對照組(P=0.015 7)，見圖1A。與對照組比較，腦梗死損傷組患者血清TNF-α表達水平升高(P=0.038 8)，見圖1B。進一步對所有血清標本miR-181d和TNF-α表達水平進行相關性分析，結果表明TNF-α和miR-181d的表達水平呈負相關(r=-0.703 8，P=0.000 4)，見圖1C。

2.2miR-181d和TNF-α在MCAO模型小鼠血清中的表達變化及相關性 利用qRT-PCR和ELSIA檢測假手術組和不同時段腦梗死組小鼠血清miR-181d和TNF-α的表達水平。結果表明，腦梗死組小鼠血清miR-181d表達水平低于假手術組，并且miR-181d表達水平隨著腦梗死發生時間的不斷增加而降低，見圖2A。與之相反，TNF-α在腦梗死組小鼠血清中的表達水平高于假手術組，并且隨著腦梗死發生時間的不斷增加而升高，見圖2B。在小鼠MCAO模型血清中，miR-181d和TNF-α的表達水平呈負相關(r=0.965 3，P=0.001 8)，見圖2C。

A：人類TNF-α 3′-UTR的miR-181d結合位點模式圖，突變序列顯示在下方； B：報告基因實驗檢測miR-181d與TNF-α 3′-UTR的結合；C：100 nmol/L miR -181d的類似物轉染到野生型的THP-1細胞中，qRT-PCR檢測miR-181d的表達；D：miR -181d的類似物轉染到野生型的THP-1細胞中，Western blot檢測TNF-α的表達；*：P<0.01，與Ctrl mimics比較

圖3 miR-181d通過結合到3′-UTR抑制TNF-α表達

2.3miR-181d對TNF-α的抑制作用 通過在線分析軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_71/)搜索發現miR-181d潛在與TNF-α的3′UTR的500～507 bp位置發生結合，且進化上高度保守(圖3A)。接下來構建了野生型和突變型的TNF-α 3′UTR片段(針對miR-181d潛在結合位點)，并將它們連接到報告基因質粒psiCHECK2上。然后同時轉染miR-181d 模擬物或對照模擬物及含TNF-α 3′UTR的報告基因質粒于HEK-293T細胞中。檢測結果表明，miR-181d模擬物可以顯著抑制含野生型TNF-α 3′UTR的報告基因的活性，表明miR-181d可以與TNF-α 3′UTR結合。但是當miR-181d的潛在結合位點發生突變后，抑制作用減弱，說明這個結合位點對miR-181d來說，是十分重要的(圖3B)。進一步在THP-1細胞中過表達miR-181d(圖3C)，發現TNF-α的蛋白水平降低(圖3D)。

3 討 論

miRNA在腦發育和功能上起著十分關鍵的作用，血液循環中的大部分miRNA并不是從破碎的組織細胞被動漏出，而是從受損組織細胞主動分泌進入血液循環，并進入靶細胞發揮作用。本研究中結果顯示，腦梗死患者血清miR-181d的表達水平明顯低于健康對照人群。此外，本研究成功建立了小鼠MCAO模型，在MCAO模型小鼠中血清miR-181d水平明顯低于假手術組，并且隨著病程的延長持續降低。總的來說，這些發現證實血清miR-181d的下調可以作為腦梗死的一個生物標志物。本研究的不足之處在于沒有確定血清miR-181d下調的原因。另一方面，由于本研究所使用的臨床病例數較少，其結論的推廣確立有待擴大樣本的前瞻性臨床研究證實。

研究表明炎癥是腦梗死的關鍵因素[8]，白細胞介素(IL)-1、IL-2、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12、轉化生長因子β1(TGF-β1)等炎性因子均參與了腦梗死的發生、發展[9-12]；腦梗死患者血清TNF-α、IL-2、TGF-β1等水平明顯升高，TNF-α、IL-2、TGF-β1可促進腦組織的炎性反應及血管斑塊的形成，上述炎性因子的表達水平與病情嚴重程度及梗死面積相關。本研究在腦梗死患者血清標本中同樣檢測到TNF-α表達水平升高。此外，在小鼠MCAO模型中血清TNF-α水平亦表現為上調。相關性分析顯示，在臨床樣本和小鼠模型中，miR-181d和TNF-α的表達均呈明顯負相關。說明miR-181d和TNF-α之間存在著潛在的調控關系。關于這一點，在其他的研究和體系中也得到證實。在星形膠質細胞中，HUTCHISON等[13]研究發現敲除miR-181可以增強高遷移率組蛋白B1(HMGB1)的產生并促使脂多糖(LPS)誘導產生多種炎性因子，同時過表達miR-181會導致炎癥抑制因子IL-10的表達升高。DAN等[14]研究發現在膿毒癥多導致的免疫麻痹過程中，烏本苷可以通過誘導miR-181的轉錄，導致TNF-α mRNA水平的降解和蛋白水平的下調。然而，也有文獻報道，miR-181和TNF-α在功能上也有可能存在正向的協同作用。GHORBANI等[15]發現在小鼠成纖維細胞中，過表達miR-181可以增強TNF-α所誘導的線粒體膜電位的降低和隨后發生的細胞凋亡。本研究同時利用雙熒光酶報告基因和Western blot實驗證明miR-181d可以通過與TNF-α mRNA的3′-UTR 區域相結合來抑制TNF-α的表達。說明炎性細胞是血清中miR-181d作用的靶細胞之一。在正常的生理過程中，miR-181d的表達抑制炎性反應的發生。而在腦缺血疾病發生時，miR-181d的表達出現下調，血清中miR-181d的表達也隨之降低，后者的表達下降會導致炎性細胞中TNF-α表達的升高。也就是說，miR-181d的表達變化不僅可以作為臨床腦缺血性疾病的診斷和預后指標。同時過表達miR-181d不失為治療和改善腦梗死的一種潛在選擇。在后續的研究中，需要利用細胞和動物實驗進一步明確miR-181d在腦梗死過程中所發揮的功能。另一方面，miR-181d作為miRNA，可以參與調控多種信號通路的轉導，這方面有待進一步的研究。

miR-181家族共有miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d四個miRNA。它們分別由不同染色體區域轉錄而成，且序列上高度相似。有關4種亞型在腦缺血性疾病研究中的深入程度有所不同，以miR-181a的研究最多。如小鼠腦卒中后，miR-181a抑制劑的治療可以改善小鼠的行為學指標[5]。而OUYANG等[16]卻發現miR-181a可以通過靶向GRP78使腦缺血病情惡化。此外，MA等[17]研究表明在臨床腦卒中患者中miR-181c的表達升高，同時miR-181c可以促進神經瘤母細胞Neuro-2a的凋亡。在小鼠MCAO模型中，miR-181類似物的處理可以降低小神經膠質瘤細胞的激活并促進凋亡細胞的表達[7]。本研究檢測到腦梗死患者和小鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)模型血清miR-181d表達下調，血清TNF-α表達升高，并進一步在人胚腎細胞(HEK-293T)細胞和THP-1細胞中證明miR-181d可以抑制TNF-α的表達。結合前述報道，系統地闡明了miR-181家族各成員在腦缺血性疾病中的表達譜及其功能的差異。