片仔癀對人結腸癌SW480細胞株的抑制作用研究

孫平良 黃深 歐海玲 韋龍祥 袁代解 耿曙光 劉佳麗 楊坤

結直腸癌（colorectal cancer）是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發病率位居世界惡性腫瘤發病率第2位，位居我國惡性腫瘤中第3位，且其發病率和死亡率均呈逐年上升趨勢［1-2］。抗癌藥物是腫瘤治療的主要方式之一，作為FOLFOX聯合化療方案藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）在治療結直腸癌中有著廣泛的應用，但也存在嚴重的毒副作用以及耐藥性等問題［3-4］。片仔癀是我國傳統名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃及蛇膽等藥物經獨特生產工藝制作而成，具有清熱解毒、散瘀消腫、活血止痛的功效［5］。大量的實驗和臨床研究結果表明，中藥內服在防治腫瘤方面有著獨特優勢，其能降低腫瘤放化療引起的毒副作用、減輕患者痛苦、改善患者生活質量等。但是，片仔癀等中藥制劑治療胃腸腫瘤的給藥途徑多為灌胃或內服，或者是體外實驗而已，直接外用治療腫瘤的研究報道少之又少。因此，能否找到一種增效減毒的中醫中藥外用方法治療結直腸癌成為中醫藥界未來探究的一大方向。本研究通過觀察片仔癀外用對人結腸癌SW480細胞株體內外的抑制效果，從而闡述其外用治療結直腸癌的價值。

材料與方法

一、人結腸癌SW480細胞株體外實驗

1. 主要材料：人結腸癌SW480細胞株購于ATCC細胞庫，RPMI1640培養基購于Gibico公司，小牛血清購于Clarkbio公司，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購于Sigma公司，5-FU購自上海旭東海普藥業有限公司，片仔癀購自漳州片仔癀藥業股份有限公司。配制前用刀片刮取漳州片仔癀，用50%的二甲基亞砜溶解配制成50 mg/mL，于 4 ℃保存待用。

2. 細胞培養：人結腸癌細胞SW480培養于含100 g/L小牛血清、1 kU/L青霉素、1 mg/L鏈霉素的 RPMI 1640培養基中，置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養箱中，細胞貼壁生長后，每2 d更換培養基，每3 d傳代1次。按5×106細胞加入凍存液1 mL的密度凍存。復蘇時，從液氮罐中取出細胞，于37 ℃快速解凍，離心去除凍存液，加入培養液培養，細胞接種次日貼壁良好，接種后2～3 d 生長旺盛。

3. 細胞增殖活力檢測（MTT法）：取對數生長期人結腸癌SW480細胞，調節細胞濃度為5×104個/mL，接種于96孔培養板，每孔加0.1 mL。按隨機數字表法分為片仔癀組（藥物濃度分 1 mg/mL，2 mg/mL，3 mg/mL，4 mg/mL，4 個亞組）、5-FU陽性對照組（濃度為10 μg/mL）和空白對照組，每組復種6孔。將細胞置于37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養箱中培養 24 h，去掉舊培養液。片仔癀組和5-FU陽性組每孔分別加入上述濃度含藥培養液0.2 mL，空白對照組加入無藥新鮮培養液 0.2 mL，繼續置于 37 ℃，50 ml/L CO2，200 ml/L O2的培養箱中培養 48 h 后，每孔加入 0.5% MTT 20 μl，繼續培養 4 h，去掉培養液，每孔加入二甲基亞颯（DMSO）100 μl，酶標儀上振蕩30 s，于波長570 nm測定光密度（OD）值。抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值×100%。細胞形態學觀察：人結腸癌SW480細胞取用2 mg/mL 的片仔癀干預 24 h、48 h、72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態變化并拍照記錄。

二、人結腸癌SW480細胞株體內實驗

1. 實驗動物：SPF級昆明種小鼠150只，雌雄各半，體重（20±2）g，同性別小鼠之間的體重相差不超過3 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號碼：SCXK桂2014-20002。

2. 主要材料：細胞培養材料同人結腸癌SW480細胞株體外實驗。抗熒光衰減封片劑、平衡鹽溶液（PBS）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（顯色法）購于bioswamp公司，甲醛購于國藥集團化學試劑有限公司。主要儀器有：正置顯微鏡（OLYMPUS公司，型號CX41），移液器（吉爾森P型移液器公司，型號P2、P10、P20、P100、P200、P1000），恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司，型號DHG-9023A），石蠟切片機（徠卡顯微系統有限公司，型號RM2235），攤片機（湖北康強醫療器械有限公司，型號TKD-TK），數碼相機（NIKON公司，型號D5100）。

3. 建模方法：細胞培養同人結腸癌SW480細胞株體外實驗。將已培養好的SW480結腸癌細胞去除培養瓶內培養基，用PBS沖洗培養瓶2次，加入體積分數為0.25的胰蛋白酶數滴消化，將消化好的細胞吸入離心管內，以600轉/min的離心機離心6 min，棄上清，加入不含小牛血清的RPMI 1640培養基3 mL，吸管吹打混勻，再離心，棄上清，按每只小鼠皮下接種細胞數2.5×109/L，再加入無血清RPMI-1640培養基，供小鼠背部皮下接種用。準備好的人結腸癌SW480細胞懸液經臺盼藍染色活細胞數占95%以上，按每只0.2 mL人結腸癌SW480細胞懸液注射于消毒后的小鼠背部皮下，觀察腫瘤移植成功率。

4. 實驗分組給藥：建模成功待瘤體生長約100 mm3后，將150只昆明小鼠隨機分為模型組，片仔癀低、中、高劑量組和5-FU組，每組30只。片仔癀低、中、高劑量組藥液濃度分別2、4、6 mg/mL，5-FU 組藥液濃度為 0.8 mg/mL。均取5 mL溶液，以紗條浸潤，完全吸收溶液后，外敷瘤處，每次外敷30 min；模型組以相同劑量的生理鹽水外敷。每日2次，連用3 d，每日觀察小鼠一般情況。

5. 抑瘤率：在治療3 d后，以頸椎脫臼法處死各組小鼠，剝離腫瘤組織，稱重，測量腫瘤長、寬及質量后，計算抑瘤率。抑瘤率以模型組和給藥組腫瘤體積及瘤體質量的變化進行計算，腫瘤體積（TV）的計算公式為TV=a×b2/2，其中a、b分別表示瘤體的長、寬。腫瘤體積抑制率=1-（實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積）×100%，瘤重抑制率=（1-實驗組平均瘤質量/對照組平均瘤質量）×100%。

6. 原位凋亡檢測（TUNEL法）：切取每組小鼠瘤體組織塊厚度約為0.2～0.3 cm，大小約為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 制作石蠟切片。（1）對于石蠟切片：①二甲苯中脫蠟5～10 min，換新鮮的二甲苯再脫蠟 5～10 min，無水乙醇 5 min，90% 乙醇 2 min，70% 乙醇 2 min，蒸餾水 2 min；②用蛋白酶 K 工作液于 21℃ ～37℃中孵育 15～30 min；③PBS洗滌3次；（2）準備TUNEL反應混合液；（3）加入50 ul TUNEL檢測液于樣品上，在濕盒、暗室中加蓋37 ℃孵育60 min；（4）用PBS沖洗3次；（5）用抗熒光衰減封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。觀察10個高倍鏡視野，以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，計數1 000個癌細胞中的表達陽性數作為凋亡指數（AI）。

三、統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件對兩組實驗數據進行統計分析，實驗數據用均數±標準差表示，比較采用t檢驗，抑制率組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、人結腸癌SW480細胞株體外實驗結果

各組對人結腸癌SW480細胞株體外抑制結果，經皮爾森（Pearson）卡方檢驗得出1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL 組抑制率與 5-FU 組比較，差異具有統計學意義（χ2=4.49，4.97，4.52；均P＜0.05）；4 mg/mL組抑制率與5-FU組比較，差異無統計學意義（χ2=3.57，P＞0.05）；2 mg/mL組抑制率與1 mg/mL、3 mg/mL組比較，差異無統計學意義（χ2=0.01，0.01；均P＞0.05）；見表1。熒光顯微鏡顯示空白組與2 mg/mL片仔癀組不同時間段人結腸癌SW480細胞株數量比較，后者均顯示不同程度的顯著減少、體積變小、折光性差、細胞懸浮、脫落死亡，見圖1。

二、人結腸癌SW480細胞株體內實驗結果

各組對人結腸癌SW480細胞株體內抑制結果經皮爾森（Pearson）卡方檢驗顯示，片仔癀高、中、低劑量組對人結腸癌SW480細胞的體內抑瘤率分別為51%、39%、23%，其中高、中劑量組與5-FU組比較差異無統計學意義（χ2=0.05，0.49；均P＞0.05），低劑量組與5-FU組比較差異有統計學意義（χ2=4.09，P＜0.05），高、中劑量組的組間比較顯示差異無統計學意義（χ2=0.87，P＞0.05），具體見表2。熒光顯微鏡顯示片仔癀各劑量組和5-FU組對人結腸癌SW480細胞均有不同程度的凋亡反應。

表1 各組對人結腸癌SW480細胞株體外抑制率

表2 各組對人結腸癌SW480細胞株體內抑制率

圖1 空白組與2 mg/mL片仔癀細胞凋亡熒光檢測圖。空白組的細胞胞質均勻，核仁清晰，細胞壁完整，伸展性良好，生長速度較快；2 mg/mL片仔癀干預后可發現的細胞形態的顯著改變，人結腸癌SW480細胞數量逐漸減少，細胞胞質渾濁，體積縮小，折光性較差，細胞數量懸浮、凋亡脫落；1A：空白對照組；1B：2 mg/mL片仔癀干預24 h對人結腸癌SW480細胞體外抑制；1C：2 mg/mL片仔癀干預48 h對人結腸癌SW480細胞體外抑制；1D：2 mg/mL片仔癀干預72 h對人結腸癌SW480細胞體外抑制

圖2 各組體外細胞凋亡熒光檢測圖。較空白組，各治療組干預后可發現的細胞形態的顯著改變，人結腸癌SW480細胞數量逐漸減少，折光性較差，細胞數量懸浮、凋亡脫落。2A：空白對照組；2B：5-FU組對人結腸癌SW480細胞體內抑制；2C：2 mg/mL片仔癀低劑量對人結腸癌SW480細胞體內抑制；2D：4 mg/mL片仔癀中劑量對人結腸癌SW480細胞體內抑制；2E：6 mg/mL片仔癀高劑量對人結腸癌SW480細胞體內抑制

討 論

結直腸癌屬于中醫“鎖肛痔”“腸覃”“積聚”“腸癖”等范疇。中醫認為結直腸癌發病的主要病機病因是“濕熱瘀毒”，以清熱解毒，活血化瘀為治療原則。現代醫學對結直腸癌的治療以手術、化療、放療等治療為主，但大部分患者發現時結直腸癌多屬晚期，常合并有腸穿孔、腸梗阻、癌性疼痛等并發癥，致手術難度大，預后較差。隨著該病發展，患者的5年生存率大幅下降［6］。中藥內服在防治腫瘤方面有著獨特優勢，中藥外用亦取得顯著療效，特別是對于那些低位結直腸癌患者。

片仔癀是我國傳統名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等藥物經獨特生產工藝制作而成，具有清熱解毒、散瘀消腫、活血止痛的顯著功效［5］。其中三七散瘀止血、消腫定痛、行滯通脈，牛黃清熱瀉火，蛇膽清熱解毒。其廣泛用于熱毒血瘀所致急慢性病毒性肝炎、癰疽疔瘡、無名腫毒及各種炎癥的治療［7］。

5-FU抑瘤的機制主要是其在細胞內轉變為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化轉變為脫氧胸苷酸（dTMP），從而影響DNA的合成［8］。5-FU對結直腸癌細胞具有抑制作用，但因其副作用大，臨床上需與其他藥物合用以降低副作用。

本實驗通過對比不同劑量的片仔癀和5-FU對人結腸癌SW480細胞進行體內外干預，觀察其抑瘤率及凋亡情況。從人結腸癌SW480細胞株體外實驗得出：片仔癀各組對SW480細胞有著顯著的抑制效果，其中，1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL組的體外抑制作用甚至優于5-FU，但不同劑量間的差別卻并不明顯，這可能與實驗設計劑量階梯差異不足夠明顯有關，亦或是SW480細胞對片仔癀的劑量變化本身并不敏感。在SW480細胞體內實驗中，發現各組對結腸癌均有不同程度的抑制作用，其中，片仔癀中、高劑量組（4 mg/mL、6 mg/mL）對人結腸癌SW480細胞株體內抑制作用與5-FU相近，兩者差異無統計學意義；而低劑量組的抑制率則不如中、高劑量組。這提示臨床應用中采用高劑量可能取得更好效果，但這一結果與體外實驗并不相同，可能與動物模型或體內環境有關，具體原因仍然需要后續進行更多動物模型運用及不同劑量的調試驗證。

根據圖2的實驗結果分析，當細胞凋亡發生時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA；細胞凋亡時抽提DNA進行電泳檢測，可以發現 180～200 bp 的 DNA ladder；基因組DNA斷裂時，暴露3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶的催化下加上綠色熒光探針熒光素標記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡檢測。基于該原理得出：①在體外實驗中，空白組的細胞胞質均勻，核仁清晰，細胞壁完整，伸展性良好，生長速度較快；2 mg/mL片仔癀干預后可發現細胞形態的顯著改變，人結腸癌SW480細胞數量逐漸減少，細胞胞質渾濁，體積縮小，折光性較差，細胞數量懸浮、凋亡脫落；②在體內實驗中，各治療組熒光顯示均弱于空白組，說明各組對人結腸癌SW480細胞均有一定程度的抑制作用。

近年來，隨著中醫中藥治療結直腸癌的不斷深入研究，其在治療結直腸癌中取得很好的效果，研究表明白花蛇舌草、敗醬草、莪術和白首烏等具有抗腫瘤作用［9-12］。片仔癀能明顯改善晚期癌癥患者疼痛、縮小瘤體、延長生命、提高生活質量等［13-14］。片仔癀直接干預結腸癌細胞培養基可以抑制結腸癌株干細胞增殖、調控ABCC1抑制結腸癌等［15-16］。片仔癀外敷腫瘤組織能有效緩解中晚期肝癌癥狀，對骨肉瘤及體外結腸癌細胞增殖具有顯著抑制作用，且其具有多層次、多途徑、多靶點的作用特點，可改善晚期結直腸癌患者生活質量，延緩病情進展等［17-18］。片仔癀外用主要是通過線粒體依賴性途徑誘導大腸癌細胞凋亡、抑制大腸癌細胞的增殖、抑制腫瘤血管新生、抑制多條大腸癌相關信號轉導通路等多方面共同起效的。但是，以上片仔癀治療結腸癌的研究，給藥途徑均是體外實驗或者使用片仔癀灌胃的方式來進行的，尚未發現有片仔癀在機體外用直接干預腫瘤的研究報道。

本次實驗通過不同濃度片仔癀直接干預人體結腸癌SW480細胞株在培養基中的增殖及外敷人體結腸癌小鼠體表瘤組織，經治療后表現出明顯的抑瘤作用，且對片仔癀產生濃度依賴性。在臨床上，中醫中藥外治如局部外敷、熏洗、燙療及中藥保留灌腸等對腫瘤患者具有一定的療效，譬如中藥保留灌腸治療低位結直腸癌。隨著科研檢測技術的不斷發展及對中藥藥理的不斷認識，中醫中藥外用有望成為治療結直腸癌的一種有效治療方法。