DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1基因多態(tài)性與晚期結(jié)腸癌臨床特征、不良反應、預后的關系

茍苗苗 張勇 千年松 司海燕 高云鶴 陳凜 戴廣海

大腸癌在我國發(fā)病率逐年上升，是我國發(fā)病率和死亡率第3的癌種［1］。隨著化療藥物及靶向藥物的出現(xiàn)，晚期大腸癌患者的生存時間延長［2-3］。以西妥昔單抗和貝伐珠單抗聯(lián)合奧沙利鉑、氟尿嘧啶類及伊立替康藥物為主的化療方案成為晚期大腸癌的標準一線治療方案［4-5］。雖然晚期腸癌患者的總生存時間（overall survival，OS）最長達到40個月，但部分患者因無法耐受化療不良反應或發(fā)生原發(fā)性耐藥或者繼發(fā)性耐藥而停止治療。在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)即使大腸癌患者單純接受相同化療方案相同藥物劑量治療時，在治療療效和耐受性方面也存在較大的個體差異。有相關研究發(fā)現(xiàn)關于藥物DNA損傷修復、藥物代謝和解毒等基因存在單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）［6-7］，這些多態(tài)性影響不同個體對藥物的敏感性和毒性。關于晚期大腸癌的基因多態(tài)性相關文獻分子機制尚不明確，且說法不一，有待進一步研究。本研究是通過Life平臺檢測基因技術檢測晚期腸癌的基因多態(tài)性，分析其與臨床特征、奧沙利鉑和氟尿嘧啶為主方案不良反應和預后的關系，從而個體化管理患者的治療方案和劑量，預防嚴重不良反應發(fā)生和預測生存。

資料與方法

一、研究設計

收集2016年3月至2018年5月在中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤治療中心初治的108 例晚期結(jié)腸癌患者化療前晨起外周血。其中男性患者70例，女性患者38例，年齡34～75歲，中位年齡53歲，所有患者均經(jīng)病理學證實為結(jié)腸癌患者。所有患者均存在遠處轉(zhuǎn)移，初治時體力狀態(tài)評分（performance score，PS）≤2分，可耐受化療。

二、化療方案與評價標準

所有患者均接受以奧沙利鉑和氟尿嘧啶為主的一線化療：L-OHP 85 mg/m2，靜滴 2 h，d1；CF 200 mg/m2，靜滴 2 h，d1～d5；5-Fu 400 mg/m2，靜滴 4 h，5-Fu 600 mg/m2，泵入 46 h；每 2 周重復，或者 L-OHP 130 mg/m2，靜滴 2 h，d1；Xeloda 1.5g po bid，d1～d14。每 3 周重復。

臨床評價標準：結(jié)直腸癌分期標準采用第七版AJCC的TNM分期標準。108例晚期大腸癌患者應用以奧沙利鉑和氟尿嘧啶的化療方案，每2或3周期進行影像學評估，使用實體腫瘤的療效評價標準RECIST1.1版，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）、疾病進展（progression disease，PD）。病情進展后更換方案，所有患者均觀察無進展生存期（progression-free survival，PFS），即從首次化療開始至證實病情進展時間。不良反應包括骨髓抑制、腹瀉、神經(jīng)毒性、乏力、口腔黏膜潰瘍、消化道反應、皮膚色素沉著等。化療后毒性反應根據(jù)常見不良事件評價標準（CTCAE）評估。不良反應的收集基于整體化療周期中最高級別記錄。

三、檢測方法

Life平臺檢測是泛生子通過自主專利One Step Seq技術進行建庫，后續(xù)通過Ion proton測序系統(tǒng)完成上機測序。1. One Step Seq 建庫：（1）將本公司設計的 One Step Seq擴增引物、barcode引物、待檢測的DNA模板、酶按SOP要求混合成所需的擴增體系；（2）一步法PCR反應進行擴增；（3）PCR結(jié)束后使用磁珠純化產(chǎn)物，去掉引物二聚體， 通過質(zhì)控后，得到滿足上機要求的文庫。2.上機測序：使用 Ion Torrent? Ion Proton 測序平臺進行測序。（1）文庫經(jīng)過油包水PCR過程完成模板富集純化，形成測序微珠；（2）將測序微珠加載到測序芯片上；（3）在proton測序儀上完成對測序芯片的檢測使用Ion Proton測序系統(tǒng)，測序過程只需2.5 h即可完成，并且能夠自動給出分析結(jié)果。

四、統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0軟件行統(tǒng)計學分析，SNP基因多態(tài)性分布情況經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。對 108例患者進行長期隨訪，用Kaplan-meier法計算生存曲線，用Log-rank檢驗比較不同基因型的PFS（即生存時間）差異。

結(jié) 果

一、基因分型及臨床特征

108例晚期腸癌患者納入檢測，共檢測了DPYD、ABCB1、GSTP1、ERCC1等4個基因。其 中 DPYD 4個位 點（rs3918290、rs55886062、rs67376798、rs2297595）均為野生型，該樣本不符合遺傳平衡檢驗。ERCC1rs11615基因頻率分別為：AA野生型5.6%（6/108），AG雜合型46.3%（50/108），GG純和突變型48.1%（52/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗（χ2=0.928，P=0.335），該樣本達到了遺傳平衡。GSTP1基因頻率分別為：野生型61.1%（66/108），雜合型33.3%（36/108），純和突變型5.6%（6/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗（χ2=0.069，P=0.793），該樣本達到了遺傳平衡。ABCB1基因頻率分別為：野生型7.4%（8/108），雜合型53.7%（58/108），純和突變型38.9%（42/108），經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗（χ2=1.996，P=0.158），該樣本達到了遺傳平衡。基因分型見表1。

表1 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性頻率分布（例，%）

結(jié)合患者臨床特征，觀察KRAS狀態(tài)和原發(fā)灶的位置與基因分布頻率的關系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤位于左右半結(jié)腸與ERCC1基因分布有關（χ2=4.802，P=0.028），與GSTP1、ABCB1基因分布頻率無關（χ2=3.691；P=0.055；χ2=1.812，P=0.178）。在92例KRAS狀態(tài)明確的患者中，KRAS突變型患者ABCB1 AG雜合突變率42.9%，KRAS野生型AG雜合突變率為72.7%，兩者差異具有統(tǒng) 計 學 意 義（χ2=3.939，P=0.047），ERCC1，GSTP1基因分布頻率與KRAS基因狀態(tài)無關（χ2=3.495，P=0.062；χ2=0.703，P=0.402）。見表2。

表2 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性與KRAS基因狀態(tài)、左右半部位的關系（例）

二、不同基因頻率與不良反應之間的關系

ERCC1不同基因頻率與不良反應無關（χ2=0，P=0.984）， 而 GSTP1 AG 型和 GG 型較 AA 型易產(chǎn)生 2～3級全身不良反應（77.8% vs. 45.5%，χ2=5.193；P=0.023）。ABCB1 GG 型和 AA 型 患者發(fā)生3～4級不良反應率為32.9%，對比AG型患者發(fā)生3～4級不良反應率為62.1%，差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=4.862，P=0.027）。見表3。

表3 ERCC1、GSTP1、ABCB1基因多態(tài)性與不良反應之間的關系

三、不同基因型與預后關系

隨訪108患者化療后中位無進展生存時間（PFS），中位PFS與ABCB1和GSTP1基因多態(tài)性無關（P=0.501，P=0.191），與ERCC1不同基因型有關，ERRC1雜合型突變（AG型）患者較純和型（GG型＋AA型）具有較短PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）（圖1）。

圖1 ERCC1基因突變類型與中位無疾病進展生存時間（PFS）關系

討 論

ERCC1是哺乳動物細胞DNA修復系統(tǒng)途徑中的一種重要的酶，與XPF形成復合物切開受損DNA鏈的5′端，XPG切開受損DNA鏈的3端，從而切除受損的片段［8］。ABCB轉(zhuǎn)運蛋白家族（ATP binding cassette transporter super family）是一大類跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，主要功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量將與其結(jié)合的底物包括化學物質(zhì)和藥物等主動泵出細胞外。ABCB1［9］又稱為多藥耐藥基因，編碼P-糖蛋白（P-gp），多種化療藥物與P-gp結(jié)合泵出細胞外。GSTP1為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutahione S-trans-ferase，GST）P1是參與外來化學物質(zhì)解毒和致癌物質(zhì)代謝滅活的多功能藥物代謝酶，它可以通過防止DNA損傷和DNA復合物形成參與奧沙利鉑等鉑類抗癌藥物的代謝，但同時其基因多態(tài)性也可以造成腫瘤細胞對化學治療藥物的耐藥［9］。晚期腸癌化療藥物主要是奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物或伊立替康聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物。上述基因均參與腸癌化療藥物代謝、功能等。因DPYD不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，未納入后續(xù)研究。

腸癌靶向治療聯(lián)合化療的時代，研究著爭論靶向藥物如何與化療更好的配伍和選擇。“左右半”之爭是2015以來最熱議的話題之一。首先明確了的一個觀點就是腫瘤部位是Ⅲ/Ⅳ期結(jié)直腸癌獨立的預后因素［5］，右半結(jié)腸癌預后顯著差于左半結(jié)腸和直腸，與治療手段無關［2］。其次，原發(fā)瘤部位是EGFR靶向治療的負性療效預測指標［5］。大多數(shù)研究者認為左右半結(jié)腸在胚胎起源、解剖學供應、腫瘤的臨床表現(xiàn)，導致了更重要的分子生物學特征的差異［10-12］。基因多態(tài)性的頻率分布是否與腫瘤原發(fā)部位左右半腸癌相關，是否影響了腫瘤的治療及預后，關于這部分目前沒有報道。本研究探索了與腸癌化療藥物相關的ERCC1，ABCB1，GSTP1基因多態(tài)性與腫瘤部位的關系。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤位于左右半結(jié)腸與ERCC1基因分布有關，與GSTP1、ABCB1基因分布頻率無關。右半腸癌ERCC1的AG型雜合突變率為40.0%，而該基因在左半腸癌AG型雜合突變率為60%，差異具有統(tǒng)計學意義。ERCC1［8］與奧沙利鉑、氟尿嘧啶類藥物化療后導致的DNA損傷修復有關，對于ERCC1突變類型與化療療效的關系說法不一。本研究結(jié)果提示左右半腸癌ERCC1基因突變頻率存在差異，這也從基因?qū)用孢M一步驗證左右半腸癌患者在生物學特征方案存在更多的差異，導致左右半腸癌預后結(jié)果不同。KRAS狀態(tài)也是影響腸癌預后的重要因素［13］，同時KRAS突變患者無法從西妥昔單抗中獲益。92例KRAS狀態(tài)明確的晚期腸癌患者中，KRAS突變患者ABCB1 AG雜合突變率42.9%，KRAS野生型AG雜合突變率為72.7%，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=3.939，P=0.047），這也提示KRAS突變患者部分藥物基因多態(tài)性存在差異，進而導致藥物的代謝濃度或耐藥性方面發(fā)生改變，從而影響生存時間。還需要進一步擴大樣本量再次驗證統(tǒng)計學上無差異的基因的多態(tài)性分布。

本研究結(jié)果顯示，晚期腸癌患者應用奧沙利鉑和氟尿嘧啶類藥物的化療方案時，GSTP1 AG型和GG型較AA型易產(chǎn)生2～3級全身不良反應的風險高，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是GSTP1 r1695由A到G的改變導致了編碼氨基酸的改變，蛋白功能性下降，使得藥物代謝排毒的能力下降，進而導致毒副作用增強。GSTP1在晚期腸癌的化療毒副反應方面的研究相對較少，但這個現(xiàn)象在乳腺癌［14］、肺癌［15］研究中得到了驗證。ABCB1 AG型患者發(fā)生3～4級不良反應率為62.1%，明顯高于其他組。目前關于ABCB1的研究大多數(shù)在乳腺癌中。有報道顯示使用紫杉類藥物的患者檢測ABCB1（3435T＞C）野生純合型（TT型）患者發(fā)生血液學毒性的風險高于其他基因型［16］。另有研究表明［17］ABCB1 2677G＞T/A基因多態(tài)性可能與乳腺癌患者AC聯(lián)合化療所致嚴重中性粒細胞減少癥風險增加有關。這些在乳腺癌中的結(jié)論似乎與本研究中的結(jié)論不一致，可能原因是這些基因產(chǎn)生的功能蛋白在各個癌種中不同化療藥物中作用機制不一致。一項關于腸癌的研究是Eva Gonzalez-Haba等人發(fā)現(xiàn)ABCB1基因的單核苷酸多態(tài)性與卡培他濱和5-Fu的不良反應相關，基因型為rs1045642（C3435T）的患者使用卡培他濱治療時發(fā)生手足綜合征也明顯降低（P=0.033），但使用5-Fu治療發(fā)生腹瀉則明顯增加（P=0.035）［18］。通過對晚期腸癌患者基因多態(tài)性的檢測，可以預測患者應用化療后發(fā)生不良反應的風險，為臨床安全用藥提供了一定依據(jù)。有望根據(jù)本研究所得結(jié)論，提出針對性的預防方案，從而保障患者用藥安全。

目前研究最多的還是基因多態(tài)性與腫瘤治療預后的關系。呂紅英等［19］研究GSTP1基因多態(tài)性與晚期肺癌鉑類化療療效和生存，發(fā)現(xiàn)GSTP1 A/G＋G/G基因型的中位生存時間為8.0個月，A/A基因型為6.0個月，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=14.688，P＜0.01）；沈冬亞等［20］研究GSTP1，ERCC1基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌FOLFOX化療方案療效相關性研究，發(fā)現(xiàn)患者性別、年齡、結(jié)直腸癌分期（TNM）及腫塊部位等和FOLFOX化療療效均無明顯相關性（P＞0.05），GSTP1單核苷酸多態(tài)性與結(jié)直腸癌對FOLFOX方案化療療效相關。梁軍等［21］研究發(fā)現(xiàn)99例晚期大腸癌患者中位TTP為7個月，ERCC1C/C基因型患者中位TTP為10個月，C/T＋T/T型患者中位TTP為5個月，二者差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。本研究中ERRC1雜合型突變（AG型）患者較純和型（GG型＋AA型）具有較短 PFS（5.6 m vs. 8.0 m，P=0.029）。這個結(jié)果和梁軍等人的研究結(jié)果相似。Park等［22］解釋該現(xiàn)象可能是因為A等位基因攜帶者的ERCC1mRNA水平更高，DNA修復能力更強，這與本實驗觀察到的GG基因型患者有較好的化療反應相一致。本研究中ABCB1和GSPT1與患者中位PFS無關，考慮ERCC1與奧沙利鉑修復相關，ABCB1和GSTP1不僅與奧沙利鉑相關，還與氟尿嘧啶類藥物的代謝有關，所以ERCC1的基因多態(tài)性更能單純反映化療的療效。

綜上所述，結(jié)合ERCC1、GSTP1、ABCC1的基因多態(tài)性和臨床特征及化療方案，從遺傳信息標記物層面更多的評估不良反應與預后，為結(jié)直腸癌個體化、精確化治療提供可行的理論依據(jù)。