ELAM-1在鼻咽癌裸鼠移植瘤中的表達及其與轉移的關系

劉露 劉麗娟 李印 黃曉新 康巍 韋波 蘇丹柯 金觀橋

作者單位：530021 南寧 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院醫學影像中心

2018年全球癌癥統計數據顯示，鼻咽癌新發病例129 079例，死亡病例72 987例［1］。鼻咽癌局部控制率已明顯提高，但遠處轉移仍是鼻咽癌治療失敗的主要原因。初診鼻咽癌患者中有4%～10%已發生遠處轉移，治療后仍有15%～30%發生遠處轉移［2］，因此研究鼻咽癌轉移相關分子標志物對預后評估和制定治療方案具有重要意義［3］。內皮細胞表達的E-選擇素（ELAM-1）與腫瘤細胞表達的配體sLex或sLea特異性結合，可以介導腫瘤細胞與內皮細胞、細胞外基質的黏附和識別，促進轉移發生。WENZEL等［4］研究認為ELAM-1是促進頭頸鱗癌轉移的分子標志物之一，它在腫瘤細胞的黏附、運動、穿出等環節中起重要作用，但未通過體內實驗進一步驗證。本研究旨在建立穩定性好且與人鼻咽癌生物學特性相似的裸鼠移植瘤轉移模型，并檢測荷瘤裸鼠移植瘤組織中ELAM-1的表達，探討其與鼻咽癌轉移的關系，為闡明鼻咽癌轉移機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與細胞株

16只BALB/c雌性裸鼠購自廣西醫科大學動物實驗中心（許可證號：SCXK桂2014-0002），體重13～15 g，鼠齡5周，隨機分配到4籠，每籠4只，飼養于廣西醫科大學動物實驗中心SPF級實驗室，飼養條件為溫度20～27℃，濕度45%～65%，給予滅菌水和飼料。鼻咽癌SUNE-1亞株5-8F（高成瘤、高轉移細胞）購自美國ATCC公司，采用蘇州凈化設備儀器廠超凈工作臺和美國Thermo公司細胞培養箱，在37℃、5%CO2飽和度條件下培養細胞。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型構建 用規格為1 mL的注射器抽取0.02 mL細胞懸液（生理鹽水重懸對數生長期的5-8F細胞，濃度為1×108個/mL），約含2×106個細胞，注射于已經酒精消毒的裸鼠左后肢爪墊，緩慢退針。每隔2 d觀察裸鼠生長狀態和成瘤情況，測量裸鼠體重及移植瘤長短徑，并根據公式V=a×b2×1/2（V為體積，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）計算裸鼠移植瘤體積。在第8周以頸椎脫臼方式處死裸鼠。

1.2.2 HE染色檢測鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的轉移情況 移植瘤、淋巴結組織和其他轉移組織標本用10%中性福爾馬林固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、4 μm厚切片，二甲苯和梯度無水乙醇脫水，用Harris蘇木精水溶液將石蠟切片染色4～8 min，將石蠟切片放入酒精伊紅染色液中2～3 min，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。移植瘤、淋巴結組織和其他轉移組織內發現癌細胞時即確定為轉移灶，根據是否出現轉移瘤，將裸鼠分為轉移組和非轉移組。

1.2.3 免疫組化SP法檢測ELAM-1的表達水平 4 μm厚切片常規脫蠟至水，預熱EDTA修復液（pH8.0）進行抗原修復，滴加1滴或50 μL過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min，滴加稀釋好的一抗（ELAM-1鼠抗人單克隆抗體，稀釋濃度為1∶100；美國默克密理博公司），37℃濕盒中孵育1 h，滴加二抗（即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTM SP檢測試劑盒，福州邁新公司），室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染30 s后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色情況。

免疫組化定量分析：在移植瘤切片中選取染色均勻、背景干凈且無壞死的區域，用EVOS FL Auto全自動細胞成像系統進行圖像采集（×400倍，曝光條件保持一致），用Image J軟件（V1.51）將圖像中的陽性區域轉為灰度圖像［5］，并計算出平均光密度值（OD），OD值越大表示ELAM-1表達水平越高。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析。計量資料數據用均數±標準差（±s）表示。采用獨立樣本t檢驗比較轉移組與非轉移組中ELAM-1的表達水平、裸鼠原始體重及4～7周后裸鼠瘤體體積的差異。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型腫瘤生長及轉移情況

裸鼠造模后1周均成瘤，成瘤率為100.0%。約30 d，裸鼠左側腹股溝可觸及腫大淋巴結，見圖1。HE染色結果顯示，10只裸鼠發生轉移（轉移組），轉移率為62.5%，其中7只僅淋巴結轉移，1只僅腹盆腔轉移，2只既發生淋巴結轉移又出現腹盆腔轉移；6只裸鼠未發生轉移（非轉移組）。兩組裸鼠原始體重差異無統計學意義［（13.83±0.56）gvs（14.62±0.30）g，t=1.026，P=0.071）］。繪制裸鼠移植瘤生長曲線，16只裸鼠潛伏期為7～14 d，造模后4～7周，瘤體體積呈指數形式增長，且轉移組移植瘤增長速度較非轉移組快，非轉移組裸鼠瘤體體積小于轉移組［（198.91±163.29）mm3vs（268.76±174.31）mm3，t=4.376，P=0.005］，見圖 2。

圖1 鼻咽癌裸鼠移植瘤模型淋巴結轉移情況Fig.1 Lymph node metastasis in nude mice

圖2 裸鼠鼻咽癌移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curves of transplanted tumor of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

2.2 鼻咽癌裸鼠移植瘤及轉移組織的HE染色結果

顯微鏡下觀察可見移植瘤組織及腹盆腔轉移組織的癌細胞呈卵圓形或圓形，核大、深染為深藍色、核分裂像增多、核質比增大，細胞異形性顯著，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。組織結構異形性明顯。

轉移組淋巴結的HE染色顯示，正常淋巴組織中可見散在大小不等的癌巢，癌細胞細胞核為深藍色且異形性明顯，胞漿及纖維組織為深淺不一的紅色；部分癌巢內可見大片壞死，與人鼻咽癌細胞形態一致，見圖3。

圖3 鼻咽癌裸鼠移植瘤及轉移組織的淋巴結HE染色結果（HE×400）Fig.3 HE staining results of lymph node xenografts and metastatic tissues of nasopharyngeal carcinoma in nude mice（HE×400）

2.3 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表達情況

所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、轉移淋巴結及遠處轉移瘤中的ELAM-1表達均為陽性，主要表達于細胞膜。轉移組移植瘤OD值大于非轉移組（0.4497±0.0705vs0.0435±0.0082，t=4.388，P=0.001），表明轉移組移植瘤ELAM-1的表達水平高于非轉移組，見圖4。

圖4 鼻咽癌裸鼠移植瘤中ELAM-1的表達水平Fig.4 Expression level of ELAM-1 of nasopharyngeal carcinoma in nude mice

3 討論

鼻咽癌主要采用以放療為主的綜合治療，局部復發與遠處轉移是其治療失敗的主要原因。鼻咽癌的轉移是一個非常復雜的過程，涉及多種基因及多條信號傳導通路，包含了多種生物學行為，但具體機制尚未完全闡明。建立動物腫瘤模型是進行腫瘤病因學、預防和治療研究中不可或缺的手段，良好的動物模型是進行后續實驗的關鍵步驟，應具備穩定性高，易操作、易重復，且移植瘤的形態及生物學特性與人體腫瘤相似。包偉晶等［6］綜述了多種鼻咽癌裸鼠模型建立的方法，其中采用CNE-2Z建立的皮下移植瘤模型成瘤率高，但其轉移率低；采用5-8F細胞系建立的尾靜脈移植瘤轉移模型雖經血道可轉移至肺、肝，但不發生淋巴結轉移，且無法確定原發瘤位置。目前尚未見5-8F細胞系爪墊移植瘤轉移模型。本研究將高成瘤、高轉移的5-8F細胞接種于裸鼠爪墊構建裸鼠鼻咽癌轉移模型，發現造模后1周左右16只裸鼠爪墊均成瘤，成瘤率為100.0%。約30 d后裸鼠腹股溝可觸及腫大淋巴結，通過病理證實16只裸鼠中10只出現轉移，其中7只僅淋巴結轉移，1只僅腹盆腔轉移，2只既發生淋巴結轉移又出現腹盆腔轉移，轉移率為62.5%，HE染色觀察細胞形態結構與人鼻咽癌細胞一致，說明本研究成功構建了高轉移、穩定性好的裸鼠鼻咽癌轉移模型。進一步繪制裸鼠移植瘤生長曲線，發現16只裸鼠潛伏期為7～14 d，原因可能是接種早期大部分癌細胞處于壞死吸收，造模后4～7周，隨著新生腫瘤血管的出現，殘存的癌細胞開始增殖并形成腫塊，腫瘤體積增長呈指數形式，后期隨代謝產物堆積、營養不足出現壞死及有絲分裂周期延長而逐漸減慢，最后進入平臺期，其生長規律符合Gompertz函數［7］，再次印證本研究建立的鼻咽癌裸鼠轉移模型具有良好的穩定性。此外，本研究發現轉移組移植瘤增長速度較非轉移組快，且兩組差異具有統計學意義，但具體原因不明。

ELAM-1是細胞黏附分子家族中的一員，具有玉型跨膜蛋白特征，由589個氨基酸構成，其結構組成包括凝集素區、表皮生長因子區、4～9個短重復序列、單一的跨膜區和1個胞漿。ELAM-1所結合的配體sLex或sLea為糖蛋白或糖脂結構，它們互為同分異構體，大量存在于多種癌組織中。已有研究報道ELAM-1的表達程度與肺癌、結直腸癌、食管癌、胰腺癌等腫瘤的轉移密切相關［8-13］。本團隊張濤等［14］前期研究發現ELAM-1在46例人鼻咽癌組織中高表達，且轉移組表達陽性率明顯高于非轉移組，提示ELAM-1可能促進鼻咽癌轉移。鄧玫等［15］亦得到類似結論。本研究成功建立鼻咽癌裸鼠轉移模型后，進一步采用免疫組化法檢測ELAM-1的表達，結果顯示所有鼻咽癌裸鼠移植瘤、轉移淋巴結及遠處轉移瘤中ELAM-1表達均呈陽性，且轉移組ELAM-1表達量明顯高于非轉移組，提示ELAM-1在鼻咽癌轉移過程中起重要作用，其在鼻咽癌細胞表面的分布，可能使腫瘤細胞更易發生侵襲和轉移。通常情況下，ELAM-1合成后以分泌顆粒的形式儲存于內皮細胞的胞質內，在白細胞介素1、α腫瘤壞死因子和細菌脂多糖等因子刺激下，內皮細胞定向活化并釋放ELAM-1，以共價鍵的形式與腫瘤細胞表面配體sLex或sLea在凝集素樣區相互結合，從而介導腫瘤細胞的滾動、黏附，而該過程是誘發腫瘤轉移的關鍵［16］。但本研究16只裸鼠解剖時間未設置明顯梯度，未能進一步研究ELAM-1與腫瘤生長時間的關系，在后續實驗中將擴大樣本量并設置明顯的時間梯度進一步研究。

綜上所述，本研究通過爪墊注射成功構建了穩定性好、轉移率高的鼻咽癌裸鼠轉移模型，且ELAM-1在裸鼠鼻咽原發癌、轉移癌中高表達，可能是鼻咽癌轉移的重要分子標志物，為鼻咽癌及轉移灶的監測、臨床治療以及患者預后評估等提供新的思路。