二甲雙胍對直腸癌細胞放療敏感性的影響

孫玉成 劉曉巍 片光哲

作者單位：133000 延吉 延邊大學附屬醫院普外科

放療是直腸癌重要的治療手段，可以提高保肛率和增加手術切除率，還可延長復發患者生存期，提高生活質量［1］。然而，直腸癌對放療的敏感性存在較大個體差異，部分患者有放療抵抗，嚴重影響放療效果［2］。二甲雙胍（DMBG）是傳統的降糖藥物，近年來在抗腫瘤方面的作用引起了研究者的關注。有研究表明，DMBG可增加卵巢癌對化療藥物的敏感性［3］，在胰腺癌、鼻咽癌、宮頸癌放療中也具有一定增敏作用［4-6］，而其對直腸癌放療的增敏作用，目前相關研究報道較少。本研究從體內外觀察DMBG對直腸癌放療敏感性的影響并探討其可能的作用機制，為提高直腸癌放療療效尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

直腸癌SW1463細胞購自美國模式培養物集存庫（ATCC），用含10%小牛血清的RPMI 1640培養基于37℃、5%CO2培養箱中常規培養，4～5 d傳代1次，傳代5次后置于-70℃冰箱凍存備用。本實驗所用裸鼠為近交系雌性BALB/c裸鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心，8～10 周齡，質量為 20～23 g，具有相同遺傳背景，共50只，在延邊大學中心實驗室SPF級條件下飼養，裸鼠健康狀況良好（合格證號：SCXK 20080002）。實驗動物的飼養和處理經延邊大學附屬醫院動物倫理管理委員會審核同意。

鹽酸二甲雙胍購自上海廣銳生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國BD公司，RPMI 1640培養基購自美國Life Technologies公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，γ-H2AX、DNA-PK蛋白檢測試劑盒、兔抗γ-H2AX多克隆抗體購自美國Trevigen公司，β-actin抗體、鼠抗DNA-PK單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。流式細胞儀購自美國BD公司，CO2恒溫箱購自美國Thermo Scientific公司，酶標儀購自美國Biotek公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，Clinac 600C/D型直線加速器購自美國Varian公司，凝膠圖像分析管理系統為北京科創銳新生物凝膠成像系統。

1.2 MTT法檢測細胞活力

取對數生長期直腸癌SW1463細胞，消化后制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/L，設實驗組和對照組，分別接種于96孔板，每孔100 μL，每組設5個復孔。實驗組加入用PBS配制的DMBG，根據預實驗結果并參照相關文獻［7］，使DMBG終濃度分別為5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L；對照組僅用等量PBS液處理，每組設調零組，加入MTT液繼續培養48 h，然后按美國Sigma公司MTT試劑盒說明書要求和步驟操作，用酶標儀測定450 nm波長處光密度值D（λ），計算細胞活力及IC50。細胞活力（%）=［D（λ）實驗組-D（λ）調零組］/［D（λ）對照組-D（λ）調零組］×100%，實驗重復 3次。

1.3 克隆集落形成實驗檢測細胞克隆形成能力

取對數生長期SW1463細胞，接種于96孔板，設對照組、DMBG組、單純照射組、DMBG+照射組，每組設5個復孔，DMBG取 10 mmol/L（約 20%IC50濃度），對照組用等量PBS液處理，藥物作用24 h后，照射組與 DMBG+照射組分別給予 0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy劑量照射，將各組細胞鋪板于60 mm培養皿中繼續培養，2周后甲醇固定，結晶紫染色，鏡下計數大于50個細胞克隆數，計算細胞克隆形成率，根據細胞克隆形成率計算細胞存活率。細胞克隆形成率（%）=（克隆數/接種細胞數）×100%，細胞存活率=各實驗組細胞克隆形成率/對照組細胞克隆形成率，繪制細胞存活曲線。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡

取對數生長期SW1463細胞，按上述“1.3”分組方法，參照文獻［8］及預實驗結果，照射組、DMBG+照射組的照射劑量取4 Gy（照射組細胞凋亡率約為20%的照射劑量），培養48 h后收集細胞，上流式細胞儀檢測對照組、DMBG組、照射組、DMBG+照射組細胞周期，加Amiexin-V-FITC/PI標記后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進行。實驗重復3次。

1.5 免疫印跡法檢測γ-H2AX、DNA-PK蛋白的表達

分組方法同上述“1.3”，將SW1463細胞接種于96孔板，每組設5個復孔，對照組與DMBG組不照射，照射組、DMBG+照射組用4 Gy劑量照射，繼續培養48 h。按照Trevigen公司試劑盒說明書要求和步驟進行操作，利用北京科創銳新生物科技有限公司的凝膠成像系統測定目的蛋白條帶凈灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin的蛋白條帶灰度值比值確定目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6 建立裸鼠移植瘤模型

取對數生長期SW1463細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成細胞懸液，用PBS液洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，重復2次，棄上清液，加PBS液將離心后沉淀的SW1463細胞稀釋至1.5×107/mL。取上述稀釋好的SW1463細胞0.2 mL注射于裸鼠上腹部皮下，1周后觀察，共有48只裸鼠造模成功，瘤體大小約為10 mm×10 mm。

1.7 荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線及抑瘤率檢測

將建模成功的48只裸鼠按隨機數字表法分為4組，每組12只：對照組給予質量濃度為0.9%的NaCl注射液；DMBG組注射DMBG；照射組給予質量濃度為質量濃度為0.9%的的NaCl注射液并照射；DMBG+照射組注射DMBG并照射，藥物作用2周，DMBG用質量濃度為0.9%的NaCl注射液溶解，濃度為100mg/mL，DMBG組及DMBG+照射組每只裸鼠每天腹腔注射50 μL DMBG，對照組及照射組僅給予等量質量濃度為0.9%的NaCl注射液進行腹腔注射，照射組及DMBG+照射組進行一次性照射，根據預實驗結果并參照文獻［8］，照射劑量為6 Gy。每周用游標卡尺測量每只裸鼠瘤體的長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V=0.52×a×b2），根據腫瘤體積變化繪制腫瘤生長曲線，至6周時用異氟烷過量麻醉法處死裸鼠，完整取出瘤體并稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

1.8 統計學方法

采用SPSS10.0統計學軟件對數據進行處理和分析，計量資料符合正態分布，結果以均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 二甲雙胍對SW1463細胞活力的影響

MTT實驗結果顯示，作用48 h后，IC50為51.20 mmol/L，對照組和 5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組的細胞活力分別為（92.31±7.25）%、（87.93±10.02）%、（78.56±9.32）%、（67.63±11.17）%、（54.39±8.41）%、（21.95±6.38）%，組間比較差異有統計學意義（F=43.283，P=0.021），5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、80 mmol/L DMBG 組分別與對照組比較，細胞活力均顯著降低（t=2.486，3.741，6.023，8.375，11.247；P=0.039，0.031，0.007，0.005，0.002）。

2.2 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞存活率的影響

實驗結果顯示，2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy 照射，DMBG組、照射組和DMBG+照射組的細胞存活率組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05），DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細胞克隆形成能力明顯下降，細胞存活率明顯降低（P＜0.05），見表1、圖 1。

表1 不同處理組SW1463細胞的存活率（n=5,%）Tab.1 Survival rate of SW1463 cells in different treatment group（n=5,%）

圖1 SW1463細胞的存活曲線Fig.1 Survival curves of SW1463 cells

2.3 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，對照組細胞凋亡率為（3.82±3.03）%，DMBG組細胞凋亡率為（16.19±4.38）%，照射組細胞凋亡率為（17.24±5.17）%，DMBG+照射組細胞凋亡率為（63.32±6.15）%，組間比較差異有統計學意義（F=39.432，P=0.032）；DMBG+照射組分別與DMBG組及照射組比較，細胞凋亡率明顯增高，差異均有統計學意義（t=8.287，9.074；P=0.037，0.031），見圖2。

圖2 DMBG聯合放療對SW1463細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on apoptosis of SW1463 cells

2.4 二甲雙胍聯合放療對SW1463細胞周期的影響

細胞周期檢測結果顯示，DMBG+照射組G0/G1期細胞比例減少，S期變化不大，G2/M期細胞比例增加，與DMBG組及照射組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明DMBG聯合放療后可促使SW1463細胞周期向放療敏感的G2/M偏移，見表2。

表2 DMBG聯合放療對SW14631細胞周期的影響（n=5）Tab.2 Effect of DMBG combined with radiotherapy on SW14631 cells cycle（n=5，%）

2.5 二甲雙胍聯合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達的影響

免疫印跡法檢測結果顯示，與DMBG組及照射組比較，DMBG+照射組可上調DNA損傷蛋白γ-H2AX蛋白的表達，下調DNA損傷修復蛋白DNA-PK蛋白的表達（P＜0.05）。見表 3、圖 3。

表3 DMBG聯合放療對γ-H2AX及DNA-PK蛋白表達的影響（n=5）Tab.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK protein（n=5）

圖3 DMBG聯合放療對γ-H2AX、DNA-PK蛋白表達的影響Fig.3 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the expression of γ-H2AX and DNA-PK proteins

2.6 二甲雙胍聯合放療對裸鼠移植瘤生長的影響

用藥6周后，完整取出實驗組和對照組裸鼠瘤體稱重并計算抑瘤率，結果顯示，DMBG組、照射組和DMBG+照射組抑瘤率分別為（20.74±2.61）%、（31.52±3.43）%和（68.51±2.58）%，組間比較差異有統計學意義（F=93.275，P=0.037），且 DMBG+照射組抑瘤率明顯高于DMBG組及照射組（P＜0.05）。DMBG+照射組裸鼠移植瘤體積和移植瘤重量均明顯變小，與照射組及DMBG組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 4、圖 4。

表4 DMBG聯合放療對裸鼠移植瘤生長的影響（n=12）Tab.4 Effect of DMBG combined with radiotherapy on the growth of transplanted tumor in nude mice（n=12）

圖4 裸鼠移植瘤的生長曲線Fig.4 Growth curves of transplanted tumor in nude mice

3 討論

直腸癌近年發病率呈上升趨勢，放療為其重要的治療手段，提高患者對放療的敏感性對預后有重要影響。二甲雙胍作為一種降糖藥物用于臨床治療2型糖尿病已有50多年歷史，2005年EVANS等［9］通過對蘇格蘭地區31萬人的數據進行分析發現，與使用其他藥物治療的2型糖尿病患者相比，使用二甲雙胍治療的2型糖尿病患者癌癥發病率下降23%，此后二甲雙胍的抗腫瘤作用引起了研究者的重視，目前已經證實，二甲雙胍對乳腺癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤具有不同程度的抗癌作用［10-11］。潘永紅等［12］報道，二甲雙胍可增強吉非替尼對體外培養的EGFR-TKIs原發性耐藥非小細胞肺癌H1975細胞的抗癌效果。蔣超等［13］研究發現，二甲雙胍對肺癌A549細胞具有放療增敏作用。劉江偉等［14］亦報道，二甲雙胍對BxPC-3和AsPC-1兩種胰腺癌細胞裸鼠移植瘤具有放療增敏作用。本實驗以體外培養的直腸癌SW1463細胞及其裸鼠移植瘤為研究對象，從體內外兩個方面觀察二甲雙胍對直腸癌細胞的放療增敏作用，發現二甲雙胍單獨作用后可抑制SW1463細胞活力，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用隨之增強；聯合放療后亦降低了SW1463細胞的克隆形成能力及細胞存活率，提高了細胞凋亡率，同時建立裸鼠模型進一步觀察發現裸鼠移植瘤的體積和重量與DMBG組及照射組相比亦明顯變小和減輕，抑瘤率明顯提高，證實二甲雙胍對直腸癌細胞具有放療增敏作用。

放療作用的核心是利用射線殺死或破壞癌細胞，抑制其生長、繁殖和擴散，癌細胞對射線越敏感，放療效果越好。研究表明癌細胞群的細胞常處于不同的細胞增殖周期中，對射線敏感性也不一致，最敏感的是M期細胞，G2期細胞對射線的敏感性接近M期，S期細胞對射線敏感性最差，G1期次之［15］。本實驗檢測SW1463細胞周期發現，二甲雙胍聯合放療后細胞周期分布發生變化，G2/M期細胞比例明顯增加，而G0/G1期細胞比例減少，細胞周期明顯向對放療敏感的G2/M期偏移，說明二甲雙胍聯合放療改變了癌細胞周期分布。射線對癌細胞可以造成損傷，但癌細胞也可通過自身修復機制修復這些損傷從而產生放療抵抗，γ-H2AX是細胞DNA損傷斷裂后形成的磷酸化染色質核小體組蛋白，是細胞DNA損傷的標志［16］。DNA-PK是DNA依賴性蛋白激酶，是基因組DNA損傷修復過程中的關鍵蛋白激酶，參與并決定著非同源末端連接DNA損傷修復通路的整個過程［17］。本實驗進一步應用免疫印跡法檢測SW1463細胞γ-H2AX及DNA-PK蛋白的表達，發現相較單獨二甲雙胍或放療作用，二甲雙胍聯合放療后γ-H2AX蛋白表達明顯上調，而DNA-PK蛋白表達明顯下調，提示二甲雙胍聯合放療可抑制SW1463細胞DNA損傷的自我修復能力。

綜上，本實驗從體內外初步證實二甲雙胍對直腸癌細胞具有放療增敏作用，其作用機制可能是二甲雙胍聯合放療改變了腫瘤細胞周期分布，抑制了腫瘤細胞DNA放療損傷后的自我修復能力。