E2F1基因過表達對人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L多藥耐藥性的影響

嚴林海 金欽文 覃宇周 陳建思 鐘華戈 唐衛中

作者單位：530021 南寧 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院胃腸外科

結腸癌是我國常見的惡性腫瘤，具有易突變耐藥的特征［1］，開展結腸癌多藥耐藥及其逆轉的研究成為目前該領域的熱點之一。E2F1是細胞周期相關性轉錄因子E2F家族成員之一，在細胞周期進展過程中具有重要的調節作用。研究發現，E2F1可促使細胞由G1期進入S期，從而促進細胞增殖而誘發腫瘤，起促癌基因作用［2-3］。研究報道E2F1可以調控ABC轉運蛋白家族，從而影響E2F1基因對黑色素瘤耐藥性的調控［4］，但是E2F1過表達對結腸癌耐藥的影響至今尚未完全清楚。本實驗通過慢病毒介導E2F1基因過表達，觀察其對結腸癌細胞耐藥性的影響并探討可能的作用機制，為提高結腸癌臨床靶向化療療效提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L購自中國科學院細胞庫（上海生命科學研究院，細胞認證編號：MXC469），E2F1過表達重組慢病毒載體（pCMAE2F1-HA）及其陰性對照慢病毒載體（pCMA-HA）由廣西結直腸癌診療中心實驗室保存［5］。流式細胞儀BD FACSCalibur購自美國BD公司，E2F1、MDR1和GAPDH一抗購自美國Abcam公司，二抗購自美國Santa Cruz公司，倒置熒光顯微鏡（TE2000）購自日本尼康公司。

1.2 細胞分組

人結腸癌耐奧沙利鉑HCT116/L細胞株培養于含10%胎牛血清及 600 ng/mL順鉑（DDP）的1640培養液中，置于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱中培養。將細胞分為HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組，HCT116/L+E2F1組和HCT116/L+NC組分別用E2F1過表達重組慢病毒載體（pCMAE2F1-HA）及其陰性對照慢病毒載體（pCMA-HA）轉染，采用倒置熒光顯微鏡觀察轉染的熒光效果。

1.3 Western blot檢測E2F1及耐藥相關基因MDR1的蛋白表達

HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組分別加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，10 000～14 000 g，4℃離心10 min后，上層液體即為蛋白裂解液。各組取等量蛋白變性后經10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，用各目的蛋白特異性一抗（E2F1、MDR1、GAPDH，稀釋濃度為1∶1 000）室溫孵育 2 h，TBST 漂洗3 次，加相應二抗（稀釋濃度為 1∶1 500），室溫孵育 1 h，TBST 漂洗 3 次，采用ECL化學發光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內參照。目的蛋白表達水平以各目的蛋白條帶灰度值與內參照灰度值的比值表示。

1.4 MTT法檢測細胞半數凋亡濃度

取對數生長期細胞，按照每孔1×106個細胞鋪板，待孔中細胞融合度達70%左右進行轉染。倒置熒光顯微鏡下觀察轉染成功后，按照各種藥物的血漿高峰濃度設置4個濃度梯度（阿霉素：0.004 μg/mL、0.04 μg/mL、0.4 μg/mL、4 μg/mL；5-FU：0.02 μg/mL、0.2 μg/mL、2 μg/mL、20 μg/mL；順鉑：0.006 μg/mL、0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL），繼續培養 48 h。各孔加入20 μL MTT（濃度為5 g/L），培養4 h，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩15 min。使用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光光度值（OD），取6個復孔的平均數，計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組OD450-陰性對照組OD450）/（陰性對照組OD50-正常對照組OD450）×100%，應用Nosa軟件計算細胞的半數凋亡濃度（IC50）。

1.5 流式細胞儀檢測細胞內阿霉素的泵出率

取對數生長期細胞，按照每孔1×105個細胞鋪板，轉染細胞72 h后每孔加入阿霉素濃度為3 mg/L的培養液，在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養。用放置在4℃冰箱的PBS洗滌細胞2次，上流式細胞儀檢測細胞內的阿霉素熒光強度，激發波長488 nm，接收波長575 nm。細胞內阿霉素的泵出率=（阿霉素的蓄積量-阿霉素的潴留量）/阿霉素的蓄積量×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況

取對數生長期細胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細胞以每孔1×105個接種于6孔板，每組細胞設3個復孔。37℃孵育48 h后，采用7AAD-PE染色標記（Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒用紅色熒光染料PE）檢測癌細胞凋亡，消化各組細胞，收集于EP管中，PBS洗滌，離心收集細胞，進行流式細胞分析。

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數生長期細胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細胞以1×105個/孔接種于6孔板，37℃孵育24 h，用20 μL移液器槍頭于培養板底部劃“一”字痕，PBS沖洗3遍，徹底洗脫懸浮細胞。然后按實驗設計，每孔加入10 μM相同濃度的無血清順鉑。分別于培養至0 h、24 h、48 h時用倒置顯微鏡拍攝劃痕邊緣進展情況，應用NIH圖像處理軟件分析細胞遷移程度。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數生長期細胞重懸，將HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細胞以每孔1×105個接種于6孔板，每組細胞設3個復孔。37℃孵育48 h后，消化各組貼壁細胞，收集于EP管中，用預冷PBS吹勻，再以1 500 r/min離心15 min，棄上清液，加入4℃已預冷75%乙醇3 mL，固定30 min，再次離心后將細胞重懸于含100 mg/L RNA酶和10 mg/L碘化丙錠的PBS中，用流式細胞儀進行單色熒光細胞流式計數，用Multiplus softwareⅡ軟件進行細胞周期分析。

1.9 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若差異有統計學意義，進一步的多重比較采用Dunnettt檢驗，以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體轉染結果

pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體和pCMA-NC-HA陰性對照慢病毒載體轉染HCT116/L細胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察，可見較多細胞發出綠色熒光，HCT116/L+NC組和HCT116/L+E2F1組轉染效率均達80%以上，且兩組轉染效率無明顯差異（圖1），說明pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體成功感染HCT116/L細胞。HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組中的E2F1蛋白表達量分別為2.62±0.59、0.37±0.09和 0.22±0.05，3組間差異有統計學意義（F=385.124，P＜0.05），進一步兩兩比較，HCT116/L+E2F1 組 E2F1 蛋白表達水平明顯高于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）（圖 2）。

2.2 過表達E2F1對化療藥物敏感性的影響

MTT法分別檢測3組細胞轉染后對阿霉素、5-FU和順鉑的IC50值（圖3），HCT116/L+E2F1組對阿霉素、5-FU和順鉑的 IC50值分別為（1.61±0.21）μg/mL、（5.22±0.12）μg/mL、（3.52±0.15）μg/mL，HCT116/L+NC組分別為（0.61±0.11）μg/mL、（3.93±0.54）μg/mL、（2.31±0.45）μg/mL，HCT116/L 組分別為（0.69±0.13）μg/mL、（4.19±0.51）μg/mL、（2.51±0.42）μg/mL，阿霉素、5-FU和順鉑的IC50值3組間差異有統計學意義（F=11.971、9.051、16.173，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組 IC50值高于 HCT116/L+NC 組和HCT116/L組（P＜0.05），說明轉染pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體后，HCT116/L細胞對化療藥物（阿霉素、5-FU和順鉑）的敏感性降低。

2.3 過表達E2F1對HCT116/L細胞內阿霉素泵出率的影響

轉染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細胞儀檢測3組細胞中阿霉素的泵出率（圖4），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組阿霉素的泵出率分別為（22.51±0.12）%、（10.92±0.09）%和（8.45±0.11）%，3組間差異有統計學意義（F=51.513，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組高于 HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖1 pCMA-E2F1-HA重組慢病毒載體轉染HCT116/L細胞的結果（×200）Fig.1 Transfection results of pCMA-E2F1-HA recombinant lentiviral plasmid vector（×200）

圖2 不同處理組HCT116/L細胞中E2F1蛋白的表達水平Fig.2 The expression level of E2F1 protein in HCT116/L cells of various treatment groups

圖3 不同處理組HCT116/L細胞對化療藥物的敏感性Fig.3 Sensitivity of anti-tumor drugs in HCT116/L cells of various treatment groups

圖4 不同處理組HCT116/L細胞阿霉素的泵出率Fig.4 Pumping rate of Adriamycin in HCT116/L cells of various treatment groups

2.4 過表達E2F1對HCT116/L細胞凋亡的影響

轉染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率（圖5），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組的細胞凋亡率分別為（6.42±0.52）%、（12.81±0.69）%和（11.45±0.31）%，3組間差異有統計學意義（F=22.682，P＜0.05），且HCT116/L+E2F1組細胞凋亡率低于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖5 不同處理組HCT116/L細胞的凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of HCT116/L cells in various treatment groups

2.5 過表達E2F1對HCT116/L細胞周期的影響

轉染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，流式細胞儀檢測細胞周期（圖6），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組S期（DNA合成期）細胞比例分別為（42.37±2.13）%、（27.54±3.69）%和（22.02±3.28）%，3組間差異有統計學意義（F=109.6，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組明顯高于 HCT116/L+NC 組和 HCT116/L組（P＜0.05），說明 HCT116/L+NC組和HCT116/L組有較少的細胞處于分裂期，而pCMAE2F1-HA對細胞進入S期的促進作用較強。

圖6 不同處理組HCT116/L細胞S期的比例Fig.6 Proportion of S phase in HCT116/L cells of various treatment groups

2.6 過表達E2F1對HCT116/L細胞遷移能力的影響

重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA轉染成功后，倒置顯微鏡鏡下觀察細胞遷移（圖7），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組細胞愈合面積比分別為（48.29±5.21）%、（36.11±4.56）%和（35.73±5.17）%，3組間差異有統計學意義（F=6.232，P＜0.05），且 HCT116/L+E2F1 組明顯高于 HCT116/L+NC 組和 HCT116/L組（P＜0.05），說明 HCT116/L+NC組和HCT116/L組細胞遷移能力較pCMA-E2F1-HA轉染后的HCT116/L+E2F1組弱。

2.7 過表達E2F1對HCT116/L細胞中MDR1蛋白表達的影響

轉染重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA 72 h后，檢測3組細胞MDR1蛋白的表達（圖8），HCT116/L+E2F1組、HCT116/L+NC組和HCT116/L組中MDR1蛋白表達量分別為（0.41±0.08）%、（0.19±0.08）%和（0.15±0.07）%，3 組間差異有統計學意義（F=20.180，P＜0.05），且HCT116/L+E2F1組高于HCT116/L+NC組和HCT116/L組（P＜0.05）。

圖7 不同處理組HCT116/L細胞的遷移能力（×5）Fig.7 Migration ability of HCT116/L cells in various treatment groups（×5）

圖8 不同處理組HCT116/L細胞MDR1蛋白的表達量Fig.8 Expression of MDR1 protein in HCT116/L cells of various treatment groups

3 討論

細胞周期相關轉錄因子E2F1是細胞內轉錄因子［6］，作為重要的細胞周期調控因子，其與pRb共同參與調控細胞由G0/G1期向S期過渡。E2F1不僅參與細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞分化，還通過一種依賴E2F家族的自身反饋調節機制調節細胞轉錄活動，E2F1可以誘導并激活miR-20a（miR-17-92簇中的一員），有抗細胞凋亡的作用，而miR-20a則能抑制E2F1 mRNA的翻譯［7］。更重要的是，有研究顯示，E2F1基因可以通過p73/DNp73-miR-205這一作用軸調控ABC轉運蛋白家族，從而影響細胞的耐藥性［4］，以上證據提示E2F1基因與腫瘤多藥耐藥性密切相關，但是E2F1對結腸癌耐藥的影響尚未清楚。本實驗成功利用重組慢病毒載體pCMA-E2F1-HA轉染人結腸癌耐奧沙利鉑細胞株HCT116/L并使E2F1穩定過表達，采用MTT、流式細胞儀等技術觀察E2F1基因過表達后對HCT116/L細胞耐藥性的影響，結果發現過表達E2F1基因后，細胞對化療藥物順鉑、阿霉素、5-FU的敏感性顯著降低，細胞內阿霉素的泵出率明顯升高，說明E2F1基因過表達可增強結腸癌耐奧沙利鉑細胞HCT116/L的耐藥性。

MDR基因在人類中有2種：MDR1和MDR2，其中MDR1與腫瘤多藥耐藥有關，MDR2的功能尚不清楚，但MDR1和MDR2基因序列具有較高的同源性。人類MDR1基因位于第7號染色體長臂上，含有28個外顯子，內含子與外顯子交界符合經典的APG配對，全長為4.5 kb。MDR1基因含有一個開放讀框，編碼1 280個氨基酸多肽，經糖基化后形成170 kU的P-gp。P-gp屬于ATP結合盒轉運蛋白超家族成員之一，由2個同源部分組成，每部分都包含6個疏水跨膜區和1個具有高度保守ATP結合位點的親水區，親水區可能含有2個核苷酸結合位點，而疏水區則含有多個與MDR有關的藥物結合位點［8］。P-gp還具有能量依賴性“藥泵”功能，可將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，使細胞內的化療藥物達不到有效作用濃度而產生耐藥性。這種由P-gp介導的多藥耐藥稱為典型多藥耐藥。目前認為P-gp作用機制是：當抗癌藥進入胞漿膜，被識別并外排，當具有疏水結構域的抗癌藥物彌散通過胞漿膜時，遇到兩側擴散而來的多藥耐藥運載體，運載體利用2個ATP結合位點上的能量將藥物泵出細胞外，細胞膜、細胞漿中產生的疏水代謝產物則作為轉運體的潛存底物，且這條通路不止一條。化療及其他藥物單一的長期治療激活了P-gp的功能，使藥物在細胞內積蓄減少，從而產生了腫瘤的多藥耐藥［9］。有研究表明［10］，MDR1為腫瘤細胞耐藥的直接相關基因，MDR1調控耐藥的機制可能是：⑴當MDR1下調時P-gp生成減少，藥物逆濃度泵出減少，使細胞內的化療藥物有效濃度提高，從而對細胞產生殺傷作用［11］；⑵MDR1表達下調可使外源性化學毒物穿過胃腸道黏膜和促進人體腸道上皮細胞吸收化療藥物，從而使體內細胞吸收的化療藥物增多［12］。研究［13］還顯示，正常細胞在氧氣充足時獲得能量是通過氧化磷酸化，極少數缺氧情況下細胞通過糖酵解獲得能量，但腫瘤細胞均通過糖酵解獲得能量。這種從正常細胞到腫瘤細胞獲取能量方式的切換，稱為代謝重編程，也認為是細胞發生癌變最重要的特征之一。NADPH氧化酶（NOX4）可促使細胞產生活性氧（ROS），一般認為細胞中ROS的積累會導致細胞凋亡，而腫瘤細胞內由NOX4介導產生的ROS不僅不會導致細胞死亡還會促進腫瘤細胞存活。NOX4介導的ROS是將腫瘤耐藥和腫瘤細胞代謝重編程結合的過程。NOX4定位于線粒體內膜中，而線粒體中ATP在亞細胞水平上的重分配扮演變構開關角色，可活化NOX4。NOX4產生的ROS可抑制PCAF依賴的乙酰化和PKM2溶酶體降解，這個過程同時伴有MDR1激活［13］。本研究發現，E2F1過表達可抑制人結腸癌耐奧沙利鉑細胞HCT116/L細胞凋亡和增加阿霉素的泵出率，上調MDR1蛋白表達，增加P-gp蛋白產生，抑制細胞吸收化療藥物，從而降低細胞的化療敏感性，而E2F1基因可能同時參與了腫瘤耐藥和腫瘤細胞代謝重編程結合的過程。

綜上所述，本研究發現過表達E2F1可降低人結腸癌耐奧沙利鉑細胞HCT116/L對化療藥物的敏感性，上調MDR1蛋白表達，減少化療藥物在細胞內的蓄積濃度，增強細胞的多藥耐藥性，E2F1基因在結腸癌多藥耐藥性逆轉中可能扮演重要角色。本研究僅是細胞實驗驗證，未進行動物實驗，且缺乏大規模的臨床樣本輔證，今后將補充上述實驗，進一步觀察E2F1基因過表達后結腸癌細胞多藥耐藥性對其他信號通路的影響，更深入和全面地探討其可能的作用機制。