體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)綜述報(bào)告

李萍 沈?qū)W彬 周玉燕 李姣 韓建

【摘 要】細(xì)胞增殖是高等生物體最為重要的生命特征，腫瘤細(xì)胞以具有無(wú)限增殖潛能為特征。本文介紹了體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖方法研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了四種檢測(cè)方法并分析了每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期為抗腫瘤藥物篩選及新藥的研發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】細(xì)胞增殖;腫瘤;體外檢測(cè)

中圖分類號(hào)： R446.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 2095-2457（2019）03-0138-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.03.058

A review of in vitro assay of tumor cell proliferation

LI Ping1，2 SHEN Xue-bin1，2 ZHOU Yu-yan1，2 LI Jiao1 HAN Jian1 WANG Guo-dong1，2

（1.Wannan Medical College， Wuhu Anhui 241002， China;

2.Anhui Provincial Engineering Research Center for Polysaccharide Drugs， Wuhu Anhui 241002， China;

3.Anhui Provincial Key Laboratory of Active Biological Macro-molecules， Wuhu Anhui 241002， China）

【Abstract】Cell proliferation is the most important life feature of advanced organisms， and cancer cells are characterized by unlimited proliferation potential. This paper introduces the research progress of detection methods of tumor cell proliferation in vitro， focusing on the advantages and disadvantages of each method， in order to provide reference for the screening of anti-tumor drugs and the research and development of new drugs.

【Key words】Cell proliferation; Ccancer; In vitro detection

癌細(xì)胞最基本的特點(diǎn)就是具備無(wú)限增殖的潛能[1]。持久的增殖信號(hào)是腫瘤的主要特征之一，正常組織可以精準(zhǔn)控制促細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)的生成和釋放，從而指導(dǎo)細(xì)胞增殖分化周期性進(jìn)行，維持細(xì)胞數(shù)量的平衡，但腫瘤細(xì)胞本身可產(chǎn)生生長(zhǎng)因子受體，從而不能實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為持續(xù)的增殖信號(hào)刺激，無(wú)限的分裂增殖[2-3]。細(xì)胞的增殖需要染色體末端的端粒參與，正常細(xì)胞中端粒隨著增殖逐漸變短，而無(wú)限增殖的腫瘤細(xì)胞中存在端粒末端轉(zhuǎn)移酶，該酶只在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并且可以將端粒重復(fù)片段加端粒DNA的末端，阻止的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入衰老和凋亡[4-6]。因此檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物是否有效的重要指標(biāo)[7]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)因方便快捷，越來(lái)越受到青睞。本文主要綜述體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖方法并對(duì)每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)加以簡(jiǎn)單的分析。

1 比色法

1.1 MTT法[8]

四唑鹽（MTT）法是最為經(jīng)典的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的方法?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性四唑鹽還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞不具備該能力沒(méi)有這個(gè)現(xiàn)象。細(xì)胞到達(dá)設(shè)定的檢測(cè)時(shí)間后，加入MTT置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育4h，吸棄培養(yǎng)基后，使用DMSO溶解細(xì)胞中的甲瓚，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定吸光度值，可通過(guò)實(shí)驗(yàn)組吸光度與空白對(duì)照組吸光度比值間接反映腫瘤細(xì)胞增殖活力。

1.2 WST-1法[9]

WST-1是MTT的類似化合物是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，在電子耦合試劑存在時(shí)，可被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。MTT被琥珀酸脫氫酶還原生成的formazan結(jié)晶不融于水溶，需要DMSO或特定的溶解液來(lái)溶解;而眾所周知DMSO常溫下對(duì)人體有細(xì)胞毒性。而WST-1產(chǎn)生的formazan卻是水溶性的，不但可以省去溶解步驟，節(jié)約了時(shí)間而且減少了有毒物質(zhì)的使用，更加的安全。另外，WST-1比MT擁有更寬的線性范圍更高的靈敏度，但它需要配合電子耦合試劑使用。

1.3 CCK-8法[10]

CCK-8法是對(duì)MTT法的進(jìn)一步改良，不需要吸棄培養(yǎng)基，可直接加入原培養(yǎng)基體積百分之10的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱孵育0.5-4h，可直接酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)吸光度。該方法減少了實(shí)驗(yàn)步驟，可減少人為誤差。孵育時(shí)間一般1h，較MTT法時(shí)間大為縮短，并且可在不同時(shí)間點(diǎn)多次進(jìn)行掃描，數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確，但該試劑價(jià)格較MTT昂貴，且顏色與培養(yǎng)基顏色相近，容易導(dǎo)致漏加。

1.4 SRB法[11]

SRB法需每孔先加入三氯乙酸，4°C冰箱孵育1h后棄孔內(nèi)液體，蒸餾水洗滌后，空氣中干燥至。每孔加入100mL SRB，室溫靜置染色30min，棄染液后用1%乙酸沖洗?？諝庵懈稍锖竺靠准?50μL，10mmol/L Tris base（pH=10.5），于振蕩器上震蕩5min，使完全溶解，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定吸光度。該方法使用的試劑較多，操作也較為繁瑣，但細(xì)胞固定染色后可以放置較長(zhǎng)時(shí)間。用Tris-base溶液溶解的SRB也可穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間。因此不同時(shí)間點(diǎn)固定的細(xì)胞培養(yǎng)板可在同一時(shí)間進(jìn)行酶標(biāo)儀掃描測(cè)定。因此SRB法在檢測(cè)時(shí)間受時(shí)間的限制最小。

2 染色法

2.1 Brdu 染色法[12]

Brdu 染色法是另一種經(jīng)常用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的經(jīng)典方法。Brdu 是胸腺密啶的衍生物， 可以標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的 DNA，可以代替胸腺嘧啶，選擇性地整合到復(fù)制細(xì)胞新合成的DNA 中。這種滲入可以穩(wěn)定存在，隨著 DNA 的復(fù)制，Brdu 可以進(jìn)入子代細(xì)胞中。Brdu 特異性抗體可以用于檢測(cè) Brdu 在細(xì)胞 DNA 中的滲入，從而判斷細(xì)胞增殖能力的變化。通常在使用 Brdu 單克隆抗體之后，都會(huì)結(jié)合免疫熒光染色，顯示增殖的細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合其他細(xì)胞標(biāo)記物，進(jìn)行雙重染色，可以判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖細(xì)胞的增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要的意義 。另外，通過(guò) Brdu 染色法可以通過(guò)熒光拍照獲得影像數(shù)據(jù)，與比色法相比較數(shù)據(jù)更為豐富有層次。

2.2 EdU染色法

EdU染色法與Brdu 染色法這兩種方法原理類似，但是Brdu 染色法需要用到抗體，方法步驟繁瑣，受到的干擾多，因此EdU法目前已逐漸替代原來(lái)的Brdu 染色法，該方法處理后，EdU被Alexa Fluor 488等熒光標(biāo)記物標(biāo)記，增殖的細(xì)胞在熒光顯微鏡下發(fā)出特定熒光，因此可檢測(cè)到單細(xì)胞的增殖，可以快速便捷的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖。

3 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法[13]

前面介紹的方法，皆是終點(diǎn)觀測(cè)，不能夠?qū)?xì)胞增殖情況進(jìn)行持續(xù)性實(shí)時(shí)觀測(cè)，為了達(dá)到實(shí)時(shí)觀測(cè)細(xì)胞增殖的目的，有公司研發(fā)了實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（RTCA），該儀器使用特定的細(xì)胞培養(yǎng)板， 板中的每個(gè)孔底帶有特制電極。當(dāng)細(xì)胞在孔內(nèi)發(fā)生粘附，轉(zhuǎn)移，增殖的時(shí)候，孔內(nèi)的電阻抗發(fā)生變化，被電極實(shí)時(shí)記錄，從而獲得了相關(guān)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。RTCA不僅能夠獲得關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)，而且還可以獲得在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)的細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程。 但是該方法需要購(gòu)買實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀，并且使用的特定細(xì)胞培養(yǎng)板價(jià)格昂貴，一定程度上限制了該方法的應(yīng)用。

4 克隆形成實(shí)驗(yàn)[14]

腫瘤細(xì)胞由于惡性程度高，因而還具有一類被稱為克隆形成能力特殊的增殖能力。

克隆形成實(shí)驗(yàn)的大致流程是，在6孔板內(nèi)加入含100-500個(gè)腫瘤細(xì)胞完全培養(yǎng)基，7-14d后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，每孔加入100%甲醇1mL，固定細(xì)胞10min。棄去甲醇，每孔加入0.5%結(jié)晶紫溶液1mL，室溫染色30min后，小心吸除結(jié)晶紫溶液，清水洗板，倒置空氣干燥。檢測(cè)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。該實(shí)驗(yàn)與之前介紹的比色法、染色法、實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法可以互為補(bǔ)充。

5 總結(jié)

綜上所述， 體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)方法主要分為四類：（1）比色法：MTT法、WST-1、CCK-8法、SRB法等;（2）Brdu 染色法;（3）實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法;（4）克隆形成實(shí)驗(yàn)。每種測(cè)定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。以MTT法為代表的比色法，成本低廉，易于復(fù)制，染色法則在得到數(shù)據(jù)的同時(shí)可以獲得圖片資料，但這兩類方法只能檢測(cè)固定的時(shí)間點(diǎn)。而實(shí)時(shí)細(xì)胞分析法在方法上更為先進(jìn)，獲取的數(shù)據(jù)也更為詳實(shí)，卻需特定檢測(cè)設(shè)備及耗材。 在抗腫瘤藥物篩選中，體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖可以說(shuō)是必做的實(shí)驗(yàn)，因有些方法雖然好但可能會(huì)受制于高昂的設(shè)備及耗材而無(wú)法進(jìn)行，因此可以根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體條件，選擇適合自身的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

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