mTOR抑制劑對博來霉素誘導小鼠肺纖維化的作用研究

馬愛平 李久榮 索文昊 周偉躍 葉美治 劉群

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性肺疾病，主要表現為肺實質漸進性不可逆性纖維化進而降低肺功能為主要特征。IPF的患者會出現呼吸短促、咳嗽、不能參加日常體力活動等[1]。IPF的肺活檢病理學表現可見進行性細胞外基質沉積，肺組織結構破壞，最終導致肺功能喪失[2]。IPF發病率呈現逐步上升的趨勢，且死亡率居高不下，多為50歲以后發病，男性多于女性，其預后較差[3]。長期以來，治療IPF的藥物選擇極少，以往IPF患者主要通過肺部康復運動、氧療、肺移植及藥物治療等一系列綜合治療手段來延緩疾病發展，因此深入了解發病機制，尋找積極有效的治療方法具有重要的意義。mTOR信號是調控細胞生長與分化的重要信號通路。mTOR信號通路調控了細胞增殖或凋亡，在臨床疾病中參與了腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病的發生[4]。我們已發表的研究表明PI3K/Akt/HIF-1α的異常活化參與了肺纖維化的形成，mTOR信號通路的異常活化促進了肺纖維化形成[5]。現研究指出mTOR抑制劑能抑制小鼠肺纖維化進展和上皮向間質的轉化，但也有研究提出了爭議，故還需要尋找更多的證據來支持和探討[6-8]。雷帕霉素是一種抗真菌和免疫抑制劑，能特異性抑制mTOR蛋白，通過阻斷蛋白合成，誘導細胞周期停滯在G1期，達到免疫抑制作用。雷帕霉素主要用于器官移植抗排斥、自身免疫疾病和心臟支架涂層藥物等[9-10]。研究結果顯示雷帕霉素預處理不能有效改善博來霉素所致的小鼠肺纖維化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 由廈門大學實驗動物中心提供C57BL/6的雄性小鼠，體質量（23±1）g，全部飼養于SPF級實驗動物房。并將實驗用的C57BL/6雄性小鼠60只隨機分為博來霉素肺纖維化對照組和雷帕霉素治療組。

1.1.2 主要試劑及儀器 博萊霉素（15 mg/支，日本化藥株式會社）、兔抗小鼠p-Akt單克隆抗體（美國CST公司）、兔抗小鼠Akt單克隆抗體（美國CST公司）、兔抗小鼠p-S6單克隆抗體（美國CST公司）、兔抗小鼠S6單克隆抗體（美國CST公司）、兔抗小鼠多克隆抗體β-actin（美國Santa Cruz公司）、羥脯氨酸試劑盒（美國BioVision）、Masson染液試劑盒（武漢博士德公司）、TRIzol Reagent（美國Gibco公司）。HE染色所需試劑、Westernblot器材、化學發光凝膠成像儀等由廈門大學醫學院中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 氣管滴注博來霉素肺纖維化模型的建立及動物分組 備行氣管內滴注博來霉素構建肺纖維化模型。在小鼠氣管內滴注博來霉素前5天開始腹腔注射雷帕霉素（2 mg/kg），將60只小鼠分為腹腔注射賦形劑組30只和腹腔注射雷帕霉素（2 mg/kg）治療組（30只），連續5日。進而對60只小鼠行氣管內滴注博來霉素。即用2%戊巴比妥鈉換算成70 μg腹腔注射小鼠使其麻醉，將小鼠用特殊固定夾固定于實驗操作臺，剪去頸部鼠毛，再用碘伏消毒手術部位皮膚，小動物手術剪剪開頸前正中皮膚，鈍性分離頸前肌肉最終暴露氣管。再以1 mL注射器氣管內滴注博來霉素（2.5 mg/kg），賦形劑組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液，快速提起小鼠左右旋轉，使藥物在肺內分布均勻，最后縫合頸部皮膚。此后每日觀察小鼠生存情況和呼吸道反應，記錄每日體重及每日死亡數量，21天后處理小鼠，收集肺臟等相關標本進行下一步實驗。

1.2.2 小鼠肺病理標本HE染色及纖維化Ashcroft評分 將固定好的組織用PBS清洗兩遍，每次30 min，組織脫水，二甲苯透明，浸蠟，切片，攤片，中性樹膠封片（注意材料上的二甲苯不能干，盡量避免出現氣泡。光鏡下以各肺葉肺組織水腫、出血、炎性細胞浸潤和小氣道損傷等項病理改變。肺組織纖維化Ashcroft評分按文獻所示。每張片子取5個以上視野，求出每只小鼠肺的各項病理改變程度的平均程度，作為肺纖維化分數，然后成組統計分析Ashcroft評分。

1.2.3 Masson染色評估肺部纖維化程度 石蠟切片脫蠟至水，依次自來水和蒸餾水洗，再用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5 min，用Masson 麗春紅酸性復紅液5 min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3 min，直接用苯胺藍或光綠液染5 min，最后以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.2.4 Western blotting測定mTOR信號通路蛋白表達 將新鮮肺組織稱重，取100 mg組織加入1 mL Ripa裂解液，在超聲勻漿機上打碎肺組織，12 000 rpm，4℃離心，蛋白變性后將上清分裝存于-20℃保存。每份實驗樣品選取30 μg上樣，配制SDS-PAGE凝膠，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內并電泳，使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，設定轉膜電流為300 mA，轉膜時間為60分鐘，將蛋白轉到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，隨后使用封閉液5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST緩沖液在室溫封閉4小時，用TBST 1：1000稀釋兔抗鼠p-Akt、Akt、p-S6，β-actin一抗，孵育4℃過夜。再用TBST 1：5 000稀釋的二抗4℃孵育2 h。洗膜再于暗室中用ECL法檢測蛋白，以β-actin蛋白作為上樣量的參照。

1.2.5 羥脯氨酸含量的測定 取凍存的左肺肺組織稱重，取濕重10 mg，將樣品反復絞碎，充分混合，然后根據堿水解法測定，按標準曲線和稀釋倍數計算羥脯氨酸含量，評估纖維化病變程度。

1.3 統計學方法

研究數據應用SPSS l7.0軟件進行統計分析。計量資料以（Mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢驗或非參數檢驗，P＜0.05差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 mTOR抑制劑雷帕霉素對纖維化肺組織內mTOR信號通路的作用情況

收集博來霉素造模后21天的兩組肺組織標本，各10例。用Western blotting檢測兩組小鼠肺組織中磷酸化修飾的Akt（p-Akt）及Akt，磷酸化修飾的S6（p-S6）蛋白的表達量變化。對照組（腹腔注射賦形劑組）內小鼠肺組織的p-S6蛋白表達量增加，而p-Akt蛋白表達量減少，提示mTOR通路活化。與對照組相比，治療組經雷帕霉素預處理后，抑制了小鼠肺組織中S6蛋白的磷酸化水平，并增加了Akt Ser473位點的磷酸化水平，詳見圖1。

2.2 小鼠肺組織病理形態學變化

圖1 雷帕霉素抑制肺纖維化小鼠肺內的mTOR信號通路

圖2 雷帕霉素預處理后肺纖維化小鼠肺組織病理學分析（×200）注：圖A中，a：博來霉素對照組小鼠肺組織HE染色；b：雷帕霉素治療組的小鼠肺組織HE染色；c：博來霉素對照組的小鼠肺組織Masson染色；d：實驗組小鼠肺組織Masson染色（×20）。

對小鼠氣管內滴注博來霉素行肺纖維化模型，在纖維化病變21天時取兩組肺組織做病理切片各15例。結果顯示兩組小鼠肺組織肺泡結構均被明顯破壞，周圍纖維化條索分布。肺泡間隔增厚并伴大量炎性細胞浸潤，見箭頭顯示（圖2A a～b）。在Masson染色中，對照組與治療組均可見陽性藍染分布，實驗組肺組織可見肺間質散在纖維條索分布，呈藍染的條狀膠原纖維以氣道周圍和胸膜下分布為主。兩組肺組織均可見肺泡間隔增寬，肺泡腔縮小，肺纖維化形成明顯的表現（圖2A c～d）。圖2B為Masson染色的定量比，對照組與治療組差異無統計學意義[（1.00±0.00） vs.（1.12±0.07）]，P＞0.05。

2.3 對小鼠肺纖維化程度評估

在纖維化模型的第21天，收集所有兩組小鼠肺組織用Ashcroft評分評估60例標本纖維化嚴重程度，結果顯示兩組小鼠的肺纖維化評分差異無統計學意義[（4.45±0.12） vs. （4.62±0.74）]，P＞0.05，見圖3A。與對照組相比，實驗組小鼠肺組織中羥脯氨酸含量無增高[（0.54±0.09） vs. （0.56±0.03）]，P＞0.05，見圖3B。

3 討論

mTOR信號由磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、結節性硬化復合物（TSC1/2）等上游分子及真核細胞翻譯起始因子4E結合蛋白1（4EBP-1）、核糖體蛋白S6激酶（SK6）下游分子所組成。下游S6蛋白的磷酸化是mTORC1活化的標記，活化的mTORC1繼而通過下游的S6K1和4EBP1磷酸化促進細胞內關鍵蛋白的轉錄、翻譯和自噬表達，促進了蛋白的合成和細胞生長[11-12]。

我們已發表的研究顯示肺纖維化病變的小鼠肺組織存在mTOR的過度活化，異常活化的mTOR參與了肺纖維化發病過程。其可能機制與肺組織中釋放纖維化細胞因子表達增加、肌纖維化母細胞增生，進而促進了膠原蛋白的合成有關[13]。還有數據顯示用CCSP/TGF-α轉基因小鼠構建肺纖維模型，mTORC1的下游因子S6K活化后加重了肺纖維化病變，而使用S6K抑制劑LY2584702干預則抑制了肺纖維母細胞的增殖和纖維化發病[14]。在體外IPF患者肺纖維母細胞中，mTORC1/2抑制劑P529抑制了TGF-β誘導的肌纖維母細胞的分化和基質金屬蛋白酶的沉積[15]。抑制mTOR的異常活化是否是治療肺纖維化的新方向需要進一步明確。

在本研究結果中，我們在肺纖維化造模前第5天腹腔注射mTOR信號抑制劑雷帕霉素預處理，小鼠一般狀態尚可。Western blotting結果顯示治療組中p-S6表達下降，提示雷帕霉素有效抑制了肺纖維化組織中mTOR活性。給予雷帕霉素同賦形劑組相比，肺病理損傷結果大致相似，兩組肺組織均有炎癥細胞浸潤、肺泡結構破壞、膠原纖維在肺泡間隔沉積呈現肺間質纖維化表現。進一步分析提示賦形劑組與雷帕霉素組在膠原纖維表達方面無差異。實驗結果中Ashcroft評分和羥脯氨酸含量檢測在兩組小鼠中無統計學變化，說明雷帕霉素預處理不能有效改善博來霉素所致的小鼠肺纖維化損傷。

圖3 肺纖維化程度的評估

但本研究中也存在局限的地方，氣管內滴注博來霉素造模前第5天使用雷帕霉素預處理可導致小鼠體重增長受到抑制。雷帕霉素連續用藥或多次間斷給藥是否能更有效改善小鼠肺纖維化病變。在我們的預實驗結果中，進一步增大雷帕霉素劑量可引起小鼠過度消瘦不耐受纖維化病變從而增加死亡率。故更合理的調整雷帕霉素用量與用法改善肺纖維化病變仍需進一步摸索。在今后的研究工作中，我們還需進一步了解雷帕霉素后期治療是否能改善博來霉素所致的小鼠肺纖維化。