交叉引物等溫擴增技術在EHEC檢測中的應用

劉文鑫 袁超文 馮瑜菲

腸出血性大腸桿菌O157：H7是一種比較常見的血清型菌株，其會導致患者出現出血性結腸炎或者是溶血性尿毒綜合癥等一系列對患者的身體健康造成嚴重傷害的疾病[1]。在感染O157：H7之后，疾病的發展速度比較快，患者的病情如果再短期內無法得到控制極有可能死亡，在世界各國都曾有因O157：H7感染暴發所導致的大范圍死亡情況出現，這種感染對公眾的生命健康造成了極其嚴重的威脅，引起世界衛生部門的廣泛關注。因此，必須要建立起兼備特異性、靈敏度與快速性的檢測方法，對O157：H7進行快速檢測[2]。在現階段，我國仍然沿用傳統的GB/T4789.4-2010作為對O157：H7進行檢測的依據，其在實踐中已經暴露出了越來越多的缺點，采用這種方法來進行檢測消耗的時間比較長，檢出率也比較低，不能做到快速檢測。ELISA和PCR等檢測方法也可以對O157：H7進行檢測，且檢測的速度比較快，但是，需要注意的是，采用這些檢測方法時仍然存在缺陷，或是特異性不夠高，或是靈敏度比較低，操作起來比較困難，在檢測實踐中不易上手，對檢測人員、場地和設備的要求相對來說都比較高，不能適應出入境口岸的檢測速度要求[3-4]。交叉引物等溫擴增技術（CPA）是近年來研究出的一種新型檢測技術，其反應系統由交叉引物、玻璃引物和監測探針組成，主要由BstDNA聚合酶及MgSO4等具備DNA鏈置換功能的成分構成，通過基于膠體金免疫層析技術的核酸試紙條，這些反應成分的擴增產物可以展開特異性檢測[5]。交叉引物等溫擴增技術的擴增溫度一直保持同一個數據，在進行檢測的過程中，所需要使用的操作設備為普通的加熱器，檢測在密閉環境中進行，肉眼可見檢測結果，所以對反應條件和技術人員檢測技術的要求也相對較低，完全避免了交叉污染所造成的假陽性反應出現[6]。在此次研究當中，對應用交叉引物等溫擴增技術來進行腸出血性大腸桿菌O157：H7的特異性、靈敏度、準確性以及檢測所耗時間進行了分析，以期對在實踐中應用此種檢測方法的實用性進行探究。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品與菌株

食品檢測樣品。在此研究當中所使用的食品檢測樣品共70例。

菌株。研究中所用的腸出血性大腸桿菌O157：H7共計三株，包括標準株和地方株。除此之外的13株分別是腸產毒型大腸埃希菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、幽門螺桿菌、空腸彎菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、結核分桿菌、產氣莢膜梭菌、假絲酵母菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、化膿性鏈球菌。金黃色葡萄球菌、結核分桿菌、產氣莢膜梭菌購自廣東省微生物研究所，其他菌株從中國藥品和生物制品鑒定研究院買入。

1.2 儀器

在此次研究當中使用的設備分別是：購自于BioRad公司的熒光定量PCR儀以及購自于生物梅里埃公司的全自動微生物鑒定儀。

1.3 試劑及培養基

此次研究當中所使用的試劑盒分別是：購自北京百奧萊博的O157：H7實時熒光定量PCR試劑盒、購自于上海拜諾生物科技公司的DNA快速提取試劑盒以及大腸桿菌O157：H7檢測試劑盒。

此次研究當中所使用的培養基分別是：購自于廣東環凱生物科技公司的普通營養肉湯、普通營養瓊脂平板、山梨醇麥康凱培養基以及購自于寧波天潤公司的腸出血性大腸桿菌O157：H7診斷血清。

1.4 方法

1.4.1 模擬食品樣本及菌株DNA模板的制備 首先需要將本次研究所需要的16種菌株在普通平板或者是血平板上進行接種，培養溫度保持在37℃，培養時長則應該控制在18～24 h，選取單個菌落提取細菌DNA，在提取過程當中應該嚴格按照試劑盒上的操作說明來進行提取。

模擬實物樣本則需要在實驗購入的普通營養肉湯當中進行增菌，培養溫度保持在37℃，培養時長則應該控制24 h左右，在吸取增菌液之后采用試劑盒進行細菌DNA提取工作。

1.4.2 CPA引物與探針的設計 在此次研究中CPA引物與探針需要根據O157：H7的基因特征保守型序列進行設計[7-8]。其中，擴增產物以及各引物、探針的序列為：

C A G T C G T A C C G G G A T C C A G A T A A A T C G CC A T T C C T T G A C T A C T T C T T A T C T G G A T TT A A T G T C C C A T A G T G G A A C C T C A C T G A C GC A G T C T G T G G C A A G A G C G A T C T T A C GG T T T G T T A C T G T G A C A G C T G A A C C T TT A C C T T T T C G G C A A A T A C A G A G G GG A T T T C G T A C A A C A C T G G A T G A T C T C A G TGGCCGTTCTTATGTAATGACTCCTGA

剝離引物的序列為：

EHECVT1F3：5-CAGTCCTACGGGGATCCAG

EHECVTIB3：5-TCACCAGTCATTACATAAG

交叉引物的序列為：

E H E C V T I C P F 2：5-G C T C T T G C C A C A G A C TGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT

檢測探針的序列為：

EHECVTIDR5B：5BIOTIN-CCTCTTCCCA-CAGACTCCCTC

EHECVT1DR5F：5FTTC-AGGTTCCCCTAT-CCGACAT

1.4.3 CPA擴增反應及檢測體系 在PCR反應管當中加入擴增反應試劑、ddH20和制備完成的DNA模板，劑量分別為：10 μL、6 μL和4 μL，總體積保持三項試劑相加數量不變，將其在反應管當中擴增1 h，溫度控制為63℃。擴增完成之后將之放入檢測裝置，在檢測中質控線和檢測線都出現顯色條帶，假設顯色深于比色卡條帶顏色，則可以判定為陽性，若否之，則為陰性。

1.4.4 模擬食品樣本中EHECO157：H7的檢測 對采用CPA法進行檢測過的EHECO157：H7為陰性的牛肉加入到磷酸鹽緩沖液制成勻漿，牛肉數量為20 g，磷酸鹽緩沖液劑量為80 mL，制作完成之后取1 mL接種EHECO157：H7標準菌株（濃度已知），在混勻之后將其作為模擬食品樣本的原樣，模擬70份含此菌株以及不含此菌株的樣品，采用分離培養鑒定法、CPA法以及熒光定量PCR法等三種檢測方法來進行檢測。

1.5 觀察指標

1.5.1 CPA-EHECO157：H7檢測體系的特異性 取本次研究所選取的全部16株菌株在按照上述方法制備DNA模板之后進行擴增檢測，對其特異性進行驗證。

1.5.2 CPA-EHECO157：H7檢測體系的敏感性 選取經過增菌培養之后的EHECO157：H7標準株的菌液，劑量選擇為1 mL，采生理鹽水按照10倍的比例來進行稀釋工作，在LB平板上涂抹不同稀釋倍數的培養物，溫度保持在37℃的情況下培養8～10 h，培養時間為夜間，對每毫升培養物當中的菌落進行計數，與此同時，需要取以上各個濃度的稀釋液制備各自的模板，并對其進行CPA以及熒光定量PCR檢測，對檢出濃度為各模板中最低的樣本反復進行測定，最少測定次數為10次，若95%以上測定該樣本為陽性，則可以確定最低檢測值就是該濃度。

1.6 統計學處理

在此次研究當中的資料均使用SPSS 17.0來進行檢測，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 CPA檢測體系的特異性

所抽選的菌株當中只有3株EHECO157：H7菌株是呈陽性的，其余菌株的檢測結果皆為陰性。

2.2 CPA檢測體系的敏感性

標準株用瓊脂平板培養計數法10倍梯度稀釋，取理論濃度為107、106、105、104、103、102、101cfu/mL的樣本，標記N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7，用CPA進行檢測。結果為：N1～N6為陽性，N7陰性。

取最高稀釋度為樣本檢測10次，陽性率達到100%，所以最低檢出限為102cfu/mL。

2.3 模擬樣本檢測結果

采用熒光定量PCR以及CPA檢測的結果，如表1所示。

由表1當中的數據可以計算出，以熒光定量為參考，CPA法的靈敏度為97.14%（34/35），特異性為91.42%，準確率為94.28%。

一致性：χ2=0.14，根據卡方界值表P＞0.05，證明兩種檢測方法的檢測結果無差異性。

采用分離培養法以及CPA檢測的結果如表2所示。

表1 熒光定量PCR以及CPA檢測的結果（n）

表2 分離培養法以及CPA檢測的結果（n）

由表2當中的數據可以計算出，靈敏度為97.22%（35/36），特異性為94.11%（32/34），準確率為97.14%（68/70）。

一致性：χ2=0.04，根據卡方界值表P＞0.05，證明兩種檢測方法的檢測結果無差異性。

3 討論

根據臨床醫學研究，腸出血性大腸桿菌O157：H7感染的致死率比較高，由這種感染所造成的食源性疾病已經造成了世界范圍內的大問題，對食品安全造成極其不利的影響。因此，學界必須認識到對腸出血性大腸桿菌O157：H7所采用的檢測方法的特異、靈敏以及快速的重要性，從而在實踐中進行深入研究[9]。在現階段，我國仍然沿用傳統的GB/T4789.4-2010作為對腸出血性大腸桿菌O157：H7進行檢測的依據，檢測中的特異性相對來說比較低，靈敏度也比較差，檢測所需要消耗的時間比較長，實用性極差。而熒光定量PCR等其他檢測技術雖然相對來說檢測速度比較快、各項特性都比較強，但是在進行檢測的過程中對檢測環境、設備和操作技術等都有著比較高的要求，實用性比較差，不適合投入到實踐的檢測工作當中[10]。

交叉引物等溫擴增技術是一種近幾年來發展出的新技術，這種技術要在恒溫環境內進行，檢測速度比較快，特異性比較高，且對檢測設備和檢測技術的要求都比較低，非常適宜投入到大范圍的適用當中[11]。交叉引物等溫擴增技術在反應原理、反應系統、檢測等方面都較傳統的等溫擴增技術進行了創新與完善，DNA聚合酶作用于交叉引物和剝離引物，從而使多個擴增反應同時在同一模板上進行，擴增反應繁盛之后，許多單鏈DNA被置換出來，這些DNA可以繼續參與到核酸擴增反應當中，同時也可同檢測探針發生雜交反應，從而通過核酸試紙條完成特異性檢測。

交叉引物等溫擴增技術與其他等溫擴增技術相比，有著獨特的優越性：首先，這種技術相對來說完成反應所消耗的時間比較少，可以在比較短的時間內完成反應，對一些比較常見的病毒細菌DNA進行檢測的過程中，其核酸擴增反應的完成之間大多控制在1 h左右；其次，這種技術操作起來比較簡單，對反應條件的要求比較低，操作步驟比較簡單，容易上手，對操作人員的技術要求比較低，適宜在大范圍內進行普及；最后，這種技術在進行腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測時，需要的儀器相對其他檢測方法來說也極其簡單，普通的加熱器就達到了檢測標準要求[12]。

此次研究發現，采用交叉引物等溫擴增技術來進行檢測時，只有大腸桿菌O157：H7菌株的結果呈陽性，其他13株菌株均為陰性；其敏感度、特異性以及準確率都要優于其他檢測方法，檢出的速度相對來說也比較快。

綜上所述，采用交叉引物等溫擴增技術來進行腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測，對操作環境和操作人員的技術水平要求比較低，操作步驟簡單易上手，檢測特異性和靈敏度都比較強，因此檢測的結果也更加準確，檢測速度比較快，適用于我國出入境口岸的檢測以及各種食物檢測，較現階段其他腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測方法有著不可超越的優越性。