鐵皮石斛內生真菌分離鑒定及生物活性研究

蔣彥潔

寄生在健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙中部分或全部生活周期的一類真菌被稱之為植物內生真菌（Endophytefungus），其不會造成宿主明顯的病理癥狀[1]。根據內共生理論，內生真菌與宿主可能具有相同或相似的次生代謝產物[2]。由于許多具有抗腫瘤活性的天然產物已從植物的內生真菌中分離得到，再加上真菌的來源廣，從真菌切入，來開發抑菌及抗腫瘤藥物在當前比較流行[3]。鐵皮石斛的抗腫瘤功效良好，部分品種還能起到殺蟲消炎效果[4]。另外，植物內生真菌的分布和其生長地域密不可分。因此本項目通過分離浙江地理種源的鐵皮石斛中的內生真菌，并篩選其抑菌及抗腫瘤活性，以期獲得高效低毒的抑菌抗腫瘤活性物質。

1 供試材料與儀器

1.1 材料

野生鐵皮石斛采自浙江地理種源，大腸桿菌、枯草芽包桿菌、金色葡萄球菌、人胃癌MKN45細胞，由浙江中醫藥大學提供。

1.2 試劑與儀器

PDA、MS、LB培養基，PBS緩沖液（pH值7.4），細胞凍存液；0.25%膜蛋白酶，0.02%EDTA購自杭州四季青公司；胎牛血清、高糖DMEM培養基購自吉諾生物醫藥技術有限公司；其他試劑均為國產分析純：354型酶標儀（生產商：Thermo公司）；IX70倒置相差顯微鏡（生產商：Olympus公司）。

2 研究方法

2.1 活性菌株的分離

內生真菌的分離：將野生鐵皮石斛洗凈，并分別將根、莖、葉切成小片（0.5 cm），消毒方法參照嚴亮等[5]報道的方法。

2.2 抑菌活性篩選（抑菌實驗）

指示菌培養為實驗室自己培養，抗菌活性的初選應用杯碟法、菌餅法、紙片法測定。而抑菌活性菌株的復選是通過紙片擴散法來實現對活性菌株發酵液的抑菌活性的檢測。

2.3 抗腫瘤活性篩選

2.3.1 腫瘤細胞的培養與內生真菌抗腫瘤活性的測定 采用體外細胞毒活性測定的MTT法測定菌體粗提物或發酵液粗提物的抗腫瘤活性。取對數生長期的腫瘤細胞。用胰蛋白酶消化后，用完全培養基制成細胞懸浮液，血球計數板計數，隨后取80 μL接種于96孔板，按每孔5 000～8 000個細胞接種，留兩孔做空白對照。置于5%CO2，37℃培養箱中培養1 d后，加入20 μL經完全培養液稀釋的樣品（陰性對照組加20 μL培養液，空白組加入100 μL的培養液，每個樣品做3個重復），繼續培養2 d后取出，吸棄培養基，每孔加入2.5 μg/μL的MTT溶液20 μL，37℃反應4 h后，每孔再加100 μL DMSO，37℃溶解30 min；用酶標儀測量各孔吸光值（測量波長為570 nm）并計算抑制率。

2.3.2 活性物質對荷瘤小鼠抑瘤試驗 將接種后的小鼠隨機分組，活性物質設不同劑量以及生理鹽水組、陽性藥組，每組10～12只。之后繼續腹腔注射給藥（1次/d，共8 d），將小鼠的生存狀況和體質量記錄下來。實體瘤模型實驗組在最后給藥的第二天將其處死，剝離瘤塊稱其體質量，并計算抑瘤率。

2.4 活性菌株的鑒定[6-7]

2.4.1 內生真菌形態特征觀察 在顯微鏡下，觀察內生真菌的菌落、菌絲和孢子等特征，參照《真菌鑒定手冊》和《現代醫學真菌鑒定手冊》進行鑒定。

2.4.2 ITS序列系統發育分析 用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），經PCR技術，擴增出真菌基因組的rRNA基因內部轉錄間隔區（ITSs）。將PCR產物純化后測序。

3 結果

3.1 分離結果

共從采自浙江地理源的野生鐵皮石斛的根、莖、葉中分離出27株內生真菌，其中11株（40.74%）從根中分離出，莖中分離出9株（33.33%），葉中分離出7株（25.93%）。

3.2 內生真菌的抑菌活性

平板對峙實驗結果顯示，有7株有抑菌作用（至少對1種對指示菌，抑菌圈直徑大于7 mm），具體見表1。

表1 內生真菌的抑菌活性

3.3 內生真菌發酵產物的抑菌活性

上述7株內生真菌的發酵產物醋酸乙酯萃取相也顯示出了不同程度的抑菌活性。見表2。

表2 內生真菌發酵產物的抑菌活性

3.4 代謝產物醋酸乙酯部分體外抗腫瘤活性

7株菌株代謝產物的醋酸乙酯萃取對HepG2的增殖也產生了不同的抑制作用，見表3。

表3 代謝產物醋酸乙酯部分體外抗腫瘤活性

表4 內生真菌的菌落形態特征

表5 內生真菌所屬菌屬鑒定結果

3.5 內生真菌的菌落形態特征和所屬菌屬鑒定結果

所分離的內生真菌的菌落形態特征和所屬菌屬鑒定結果具體見表4和表5。

4 討論

植物的組織基本上都存在內生真菌，其種群十分龐大（約有1.5×106種）[8]。植物內生真菌的代謝產物不僅豐富且多具有一定的活性：如調節植物生長、抑菌、殺蟲、抗腫瘤等[9-10]。葉子等[11]報道，短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia）的韌皮部分離到的內生真菌Taxomycesandreanae可產生與宿主相同的抗腫瘤代謝產物紫杉醇，國內外的研究者相繼從植物內生真菌中分離到多種可產生抗腫瘤活性的天然產物，考慮到真菌的來源廣，其生產可通過發酵、菌種選育或改進和控制發酵工藝等方式來實現將所需化合物的含量提高的目的，同時這又不會將生物資源大量破壞[12]。因此，從真菌中切入，來研究開發抑菌及抗腫瘤藥物，前景較為廣闊。

鐵皮石斛（dendrobium candidum）屬微子目，蘭科多年生附生草本植物，具有生津、降血糖、增強機體免疫力等作用，鑒于鐵皮石斛具有良好的抗腫瘤功效及一定的殺蟲消炎作用，相信它們的內生真菌也具有產生與其宿主相同或相似的活性物質。另外，內生真菌的分布與宿主物種有關，也與地域有關系。

本實驗結果顯示，在浙江地理源的鐵皮石斛中共分離出27株內生真菌，其共歸屬10個屬。抑菌實驗表明有7株有抑菌作用（至少對1種對指示菌），其代謝產物的醋酸乙酯萃取相也有抑菌和抗腫瘤效果。

綜上所述，鐵皮石斛內生真菌具有豐富的種群，將其分離后可發揮潛在的抑菌和抗腫瘤活性，為抑菌和抗腫瘤候選藥物的開發提供思路。