高效液相色譜法測(cè)定消癌平片中通關(guān)藤苷G含量*

王祁民 ，李亞靜 ，2，安 靜 ，孟 璐 ，2，馬銀玲

（1.河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050051； 2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050017）

消癌平片由摩羅科植物通關(guān)藤（烏骨藤）干燥藤莖水提后經(jīng)現(xiàn)代工藝制得，具有抗癌、消炎、平喘作用，目前臨床主要用于治療肝癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤[1-6]。消癌平片藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定僅以綠原酸一種成分為指標(biāo)[7]，但綠原酸存在于多種中藥中，特異性不強(qiáng)。通關(guān)藤及消癌平中主要活性成分均為C21甾體皂苷類物質(zhì)（包括通關(guān)藤苷G）[8-9]。本試驗(yàn)中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定消癌平片中通關(guān)藤苷G含量，為消癌平片的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，配備有2487型紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；AB204-S型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo儀器有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山超聲儀器廠有限公司）。

1.2 試藥

通關(guān)藤苷G對(duì)照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)為160104，純度大于98%）；消癌平片（煙臺(tái)東誠(chéng)大洋制藥有限公司，批號(hào)分別為 20150301，20150611，20160114，規(guī)格為每片0.3 g）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（55∶45，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取消癌平片，去除糖衣，研細(xì)，取0.55g，精密稱定，置分液漏斗中，加入三氯甲烷6 mL、水24 mL，搖勻，靜置，取有機(jī)層，連續(xù)萃取3次，將所制得溶液蒸干，用甲醇復(fù)溶，并定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm微膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液：稱取通關(guān)藤苷G對(duì)照品13.4 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度為1.34 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋，制成通關(guān)藤苷G質(zhì)量濃度為67 μg/mL的對(duì)照品溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品（甲醇）溶液進(jìn)行分析，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度（2，4，8，20，40，60，80，100μg/mL）的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以通關(guān)藤苷G色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=5×106X-6 048，r=0.999 5（n=8）。結(jié)果表明，通關(guān)藤苷 G 質(zhì)量濃度在2～100 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，加甲醇制成通關(guān)藤苷 G低、中、高質(zhì)量濃度（20.0，40.0，60.0 μg/mL）的對(duì)照品溶液，各分別重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.76%，1.71%，1.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：室溫下取供試品（樣品批號(hào)為20150301）溶液，分別于 0，1，3，6，9，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.82%（n=7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批（批號(hào)為20150301）樣品粉末，6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為1.84%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取樣品粉末300 mg，9份，精密稱定，分別加入對(duì)照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批次樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果批號(hào)為 20150301，20150611，20160114的消癌平片中通關(guān)藤苷G含量分別為每片 39.8，39.4，40.1 μg。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法選擇

全波長(zhǎng)掃描顯示，通關(guān)藤苷G最大吸收波長(zhǎng)為230nm，以此確定230 nm為本試驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。預(yù)試驗(yàn)中流動(dòng)相曾采用乙腈-水等度洗脫，通關(guān)藤苷G分離度較差；選用乙腈-0.1%磷酸溶液（55∶45，V/V）為流動(dòng)相時(shí)通關(guān)藤苷G峰與相鄰峰分離好，基線穩(wěn)定，最終采用乙腈 -0.1%磷酸溶液（55 ∶45，V/V）洗脫。

3.2 質(zhì)量控制指標(biāo)選擇

通關(guān)藤及其制劑消癌平中成分較復(fù)雜，含有C21甾體苷類化合物、三萜皂苷類化合物、多糖類化合物、酚酸類化合物、生物堿類化合物、甾醇/環(huán)醇類化合物、揮發(fā)油等化學(xué)成分[8-9]。前些年的文獻(xiàn)多報(bào)道其酚酸類成分，徐佳佳等[10]、劉峰群等[11]、潘成學(xué)等[12]曾報(bào)道通關(guān)藤及消癌平中綠原酸等酚酸含量。綠原酸在忍冬科忍冬屬、菊科蒿屬等植物（如菊花、杜仲、咖啡、金銀花等）中含量都非常高。此外，一些水果和蔬菜（如菠菜、馬鈴薯、胡蘿卜等）中也含有綠原酸等酚酸成分。隨著研究的深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)通關(guān)藤及消癌平抗腫瘤主要活性成分為其中C21甾體苷類化合物[8-9]，如通關(guān)藤苷、通光素等。目前從通關(guān)藤中鑒定分離的C21甾體苷有50多種[13]，通關(guān)藤苷對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、小鼠移植S180細(xì)胞、小鼠移植P388細(xì)胞有顯著的體內(nèi)抑制作用[14]；對(duì)人宮頸腺癌荷瘤裸鼠的腫瘤生長(zhǎng)增殖均有抑制作用[15]；可抑制肝癌細(xì)胞增殖，減少甲胎蛋白分泌[16]；對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其減少自由基產(chǎn)生、提高抗氧化物酶活性有關(guān)[17]；對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化及抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路相關(guān)[18]。有必要建立以通關(guān)藤苷為指標(biāo)的消癌平片質(zhì)量控制方法，本研究中在藥典和國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，選擇了成分較明確且含量較高的通關(guān)藤苷G作為考察指標(biāo)。

綜上所述，本研究中建立的方法簡(jiǎn)單、可靠，可用于消癌平片的質(zhì)量控制。