小牛血清去蛋白對腦缺血-再灌注損傷模型大鼠血腦屏障的保護作用研究*

鄧 超，鄭永強，徐 悅

（湖北省十堰市人民醫院·湖北醫藥學院附屬人民醫院神經內科，湖北 十堰 442000）

腦卒中又稱中風、腦血管意外，為急性腦血管疾病，其中缺血性卒中占60%～70%。腦缺血觸發的病理改變會影響血腦屏障（BBB）的通透性[1]，導致腦水腫和局部炎癥。本研究中以小牛血清去蛋白用于腦缺血-再灌注損傷模型大鼠，并分析其對模型大鼠BBB的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級SD大鼠100只，雌雄各半，體質量為（250±20）g，購自湖北醫藥學院實驗動物中心，動物生產合格證號：SCXK<鄂>2017-0008，適應性喂養，自由進食和飲水，人工黑暗和光照交替，在體質量達到（270±20）g時納入實驗。本研究經醫院動物實驗倫理審查委員會批準，實驗中大鼠的處置方法符合動物倫理學要求。

儀器：JEM-2000EX型透射電鏡（日本電子光學公司）；CM3050S型冰凍切片機（德國Leica公司）；BX-51型顯微鏡及圖像分析系統（日本Olympus公司）。

試藥：小牛血清去蛋白腸溶膠囊（錦州奧鴻藥業有限公司，國藥準字H20090346，規格為每粒5 mg，批號為 2820170104）；兔抗帶狀閉合蛋白 -1（ZO-1，美國CST公司）；免疫組化試劑盒（美國Molecular Probes公司）；伊文斯藍（EB，美國 Sigma-Aldrich 公司）。

1.2 方法

建模、分組與給藥：按隨機數字表法將100只SD大鼠分為假手術組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）及小牛血清去蛋白低劑量組（C1組，7.5 mg/kg，按肽量計，下同）和高劑量組（C2組，37.5 mg/kg），各 25 只。灌胃給藥，每天1次，連續10 d。參考線栓法相關文獻[2]，阻斷大鼠大腦中動脈，于缺血2 h后再灌注24 h，以建立腦缺血再灌注損傷模型。觀察大鼠左側肢體肌力減弱，運動左偏，解剖未見蛛網膜下腔出血則表明模型復制成功。A組除不阻斷大鼠大腦中動脈外，其余操作同上。

腦組織EB染色：再灌注24 h后，于處死大鼠前1 h靜脈輸入EB 0.9%氯化鈉注射液（0.2 mL/100 g）。腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg），心臟注入0.9%氯化鈉注射液，開顱取腦，稱定大鼠腦濕質量，切碎塊，置試管中，加4 mL甲酰胺，恒溫避光環境水浴3 d，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于620 nm波長處測定吸光度值，計算腦組織EB含量。

BBB超微結構觀察：再灌注48 h內，腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠（40 mg/kg），其中 B 組大鼠固定再灌注 0.5，2，6，12，24 h 時麻醉。經左心室輸注0.9%氯化鈉注射液60 mL，灌注鑭醛固定液50 mL，開顱取腦。將腦組織從視交叉向后冠狀切片成約1 mm，分別在缺血同側和對側相應部位的皮質及底節區各取2小塊腦組織，以透射電鏡觀察再灌注0.5，2～6，12～24，48 h時大鼠BBB的超微結構。

免疫組化：再灌注24 h后，建模成功后腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠，多聚甲醛心臟灌流，取腦組織，10%甲醛溶液固定24 h，并經石蠟包埋，脫水、切片、染色。按試劑盒說明書操作，以圖像分析系統檢測ZO-1陽性血管數目。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大體、光鏡、電鏡觀察結果

大體標本可見，模型大鼠缺血側腦組織呈藍染，而對側未見藍染（見圖1），顯示大鼠腦間質及神經纖維腫脹，缺血處細胞變少，并同正常組織形成了移行帶。電鏡可見，B組大鼠腦組織內皮細胞皺縮，管腔變形，基底膜斷裂；而C2組在光鏡下缺血部位有輕度間質水腫，但不及B組的腫脹程度；腫脹程度較輕，基底膜尚未斷裂，較完整；C1組介于B組和C2組之間（見圖2）。

圖1 模型組大鼠腦組織染色大體圖

圖2 右半側大腦皮質額葉冠狀切片電鏡觀察圖（HE，×400）

2.2 BBB超微結構觀察結果

由圖3可見，A組大鼠腦組織非缺血區的腦血管內皮細胞形態、內皮細胞間的緊密連接（TJ）正常，未見鑭顆粒。再灌注0.5 h，大鼠腦組織缺血區開始腫脹，星型膠質細胞足突有輕度腫脹，但與毛細血管基底膜連接仍較緊密；內皮細胞出現腫脹，其胞質內線粒體增多，TJ處可見鑭顆粒。再灌注2～6 h后，大鼠缺血區腦組織腫脹，膠質足突及血管基底膜分離，間隙增加；內皮細胞腫脹更明顯，可見空泡，胞質內見到鑭顆粒；神經纖維微管排列不整齊，細胞間隙中有鑭顆粒。再灌注12～24 h時，大鼠腦組織缺血區嚴重腫脹，結構疏松，神經細胞、膠質細胞變性壞死，核溶解，細胞內見到鑭顆粒；基底膜不連續；鑭顆粒經血管漏出至腦實質。再灌注48 h時，大鼠腦組織缺血區基本已無正常結構，可見大量小膠質細胞，其胞質內有脂滴、壞死組織等，形似泡沫細胞；內皮細胞皺縮，胞質電子密度變大，胞質內可見髓樣體。

圖3 BBB超微結構圖

2.3 EB含量和ZO-1陽性血管檢測結果

結果見表1。與A組比較，B組大鼠腦組織EB含量顯著增加，ZO-1陽性血管數顯著減少（P<0.05）；與B組相比，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽性血管數顯著增加（P<0.05）。

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽性血管數比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽性血管數比較（±s）

注：與A組比較，#P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

組別A組B組C1組C2組EB 含量（μg/g）10.53±1.28 54.69±2.20#49.52±2.27*44.91±3.15*ZO-1陽性血管數（條）9±2 2±1#3±1 4±2*

3 討論

BBB是腦組織結構的一部分，對神經系統有保護作用，微血管內皮細胞是BBB的基本組成部分，它們形成了保障局部環境穩定的第一道防線[3]。缺血再灌注后，缺血半暗帶組織可繼續存活[4]；但再灌注會導致代謝失衡[5]，使乳酸、炎性因子及自由基等生成過多[6]，令細胞骨架變化，細胞間連接數量變少[7]，BBB通透性升高[8]。ZO-1是TJ的重要成分[9]，可參與TJ跨膜蛋白的聯系[10]，其對生化反應敏感[11]，腦缺血時，能及時應答炎性細胞因子[12]，導致相關復合體解離，最終影響BBB[13]。

本研究結果顯示，大鼠缺血區腦組織BBB通透性改變的程度與再灌注的時間緊密相關。再灌注0.5 h時，BBB的TJ開放；再灌注2～6 h時，內皮細胞出現空泡化，胞質有吞噬的鑭顆粒，說明胞膜的通透性開始增大，足突與基底膜開始分離，鑭顆粒沉積在細胞間隙；再灌注12～24 h后，BBB結構嚴重破壞，大量鑭顆粒漏入腦實質；再灌注48 h，內皮細胞不完整，大量神經細胞、膠質細胞壞死崩解，小膠質細胞胞質內充滿的脂滴和壞死組織形成的類似泡沫細胞的結構提示組織開始修復。說明BBB的通透性在再灌注24 h內逐漸升高，在48 h后逐漸降低。腦缺血模型大鼠腦組織ZO-1陽性血管數顯著減少，EB含量增多，腦水腫程度加重。其原因可能為再灌注增加的炎性因子降低了ZO-1表達，引起內皮細胞的骨架變化，跨膜蛋白的連接程度變小，BBB通透性改變，局部穩態失衡。與B組比較，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽性血管數顯著增加。表明小牛血清去蛋白可影響ZO-1蛋白表達，從而維系TJ復合體的結構，進而保護BBB。

綜上所述，小牛血清去蛋白對腦缺血再灌注損傷模型大鼠BBB具有保護作用，其機制可能與穩定缺血區腦細胞和增強ZO-1表達有關。