柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量測定及最佳采收期研究

譚苑芬，梁文能

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿屬植物EpimediumL.，主要來源于淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim，箭葉淫羊藿EpimediumsagittatumMaxim，柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，巫山淫羊藿Epimedium wushanenseT.Sying和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumMaxim的干燥葉。淫羊藿味甘、性溫，入肝、腎經(jīng)，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和祛風(fēng)濕作用，臨床主要用于腎虛陽痿、尿頻、筋骨痿軟及風(fēng)寒濕痹等證[1-3]。目前對淫羊藿的研究主要在于其化學(xué)成分的測定[4-5]和淫羊藿苷的含量測定[6-9]。淫羊藿苷為評價(jià)淫羊藿質(zhì)量的指標(biāo)性成分，具有提高人體免疫力、改善心血管功能、增加性腺功能、抗腫瘤、抗炎、補(bǔ)肝腎等功效[10-11]。本研究中參考文獻(xiàn) [12-14] 建立了測定不同采收期柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的高效液相色譜法，并分析了淫羊藿藥材的最佳采收時(shí)間。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），含四元洗脫泵、全自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器（DAD）；BSA124S型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；KG-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿對照品（批號為 110737-201416，純度為94.2%），購自中國食品藥品檢定研究院。柔毛淫羊藿藥材于2016年8月至2017年7月采收于甘肅省隴南市，經(jīng)黃昌杰副主任藥師鑒定為小檗科植物淫羊藿屬Epimedium柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim，采集植物均為生長2～3葉的植株，同一顆植物每月采收1次，連續(xù)采集12個(gè)月，以此編號為1～12，具體采收時(shí)間見表1，采收后均置陰涼通風(fēng)房間陰干，除去雜質(zhì)，備用。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 不同采收期的淫羊藿藥材質(zhì)量

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（25 ∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稱取淫羊藿苷對照品11.68mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為對照品貯備溶液，精密吸取5 mL置10 mL容量瓶中，加乙醇定容，得每1 mL含淫羊藿苷58.40 μg的對照品溶液。取采摘陰干的藥材樣品（序號為10），粉碎，過4號篩，稱取粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液和對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)不低于5 000，分離度大于1.5，分離良好。

圖1 柔毛淫羊藿高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液1，2，5，10，20 μL，按擬訂色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2.950X+4.127，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在58.40～1 168.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對照品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣 1，5，20 μL，每個(gè)體積連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為2.37%，1.06%，0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：室溫下取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別在放置 0，1，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量為10 μL，連續(xù)考察24 h，記錄淫羊藿苷色譜峰面積。結(jié)果的RSD為2.32%（n=7），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取藥材樣品（序號為10），依法同時(shí)制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測定淫羊藿苷含量。結(jié)果的RSD為0.98%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的藥材樣品粉末0.25 g，精密稱定，共6份，另精密量取對照品溶液10.12 mg，置 10 mL容量瓶中（每 1 mL含淫羊藿苷1.012 mg），分別精密量取1 mL，加入上述6份樣品中，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取前述不同時(shí)期采摘的藥材樣品，依法制備供試品溶液，各平行制備2份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算淫羊藿苷含量，測定結(jié)果按干燥品計(jì)算。結(jié)果見表3和圖2。

表3 不同采收期淫羊藿苷含量測定結(jié)果（%）

圖2 不同采收期淫羊藿苷含量折線圖

3 討論

3.1 供試品溶液制備

試驗(yàn)前先用正交試驗(yàn)考察了不同溶劑（甲醇、乙醇、稀乙醇）和不同提取方式（超聲、回流、索氏提取）對柔毛淫羊藿中淫羊藿苷含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用稀乙醇作為提取溶劑時(shí)，回流提取和索氏提取的淫羊藿苷含量均高于超聲提取，索氏提取所用溶劑較少，提取效率高，但回流提取簡單易操作，且和藥典的提取溶劑一致。因此，本試驗(yàn)中選擇稀乙醇為提取溶劑回流提取1 h作為供試品溶液的制備方法。

3.2 色譜條件選擇

本試驗(yàn)中參考2015年版《中國藥典（一部）》淫羊藿藥材[15]項(xiàng)下含量測定條件，首先對流動(dòng)相的組成和檢測波長進(jìn)行了考察，采用DAD對淫羊藿苷對照品溶液在200～400 nm內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在270 nm波長處有最大吸收，因此本試驗(yàn)中選擇檢測波長為270 nm。同時(shí)比較了以乙腈 -水，甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%溶液醋酸分別作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用藥典中所載乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，供試品溶液中淫羊藿苷的色譜峰有拖尾現(xiàn)象，且分離度不好，有干擾；而采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，供試品溶液中淫羊藿苷的色譜峰峰形良好，拖尾減少，對稱因子為1.01，理論板數(shù)高，無其他色譜峰干擾。因此，試驗(yàn)確定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，檢測波長為270 nm。

3.3 最佳采收期分析

本研究結(jié)果顯示，不同時(shí)期采收的柔毛淫羊藿藥材中淫羊藿苷含量差異較大，7月采收的含量最高（可達(dá)0.723 9%），8月后含量開始降低，2月含量最低（0.223 5%）。根據(jù)《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，淫羊藿苷是評價(jià)和控制淫羊藿藥材的重要指標(biāo)，而不同時(shí)期采收的淫羊藿藥材對其臨床使用有一定影響。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，柔毛淫羊藿的最佳采收期為每年7月，此時(shí)采收的藥材能最大限度地保證藥效，這可為開發(fā)淫羊藿藥材的利用價(jià)值提供參考。