吳茱萸次堿抗Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大作用以及對NO的影響

李世月，黃 波，周金鑫，黃 娟，石京山，蔣青松，吳 芹

(1.遵義醫科大學 基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州 遵義 563099；2.重慶醫科大學 藥理學教研室暨重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400016)

心肌肥厚是多種因素引起心肌組織超負荷代償反應的結果，與心血管病人心力衰竭和猝死的發生密切相關。在細胞水平，心肌肥厚表現為心肌細胞直徑增大、蛋白合成增加等，又稱為心肌細胞肥大，簡稱心肌肥大。心肌肥大的形成是一個復雜的病理過程，其藥物治療和作用機制一直是人們關注的熱點，但近年一直未有突破性進展。吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)是從貴州省道地中藥材吳茱萸中提取的一種吲哚喹唑啉類生物堿。Rut可促進降鈣素基因相關肽釋放，改善缺氧和異丙腎上腺素誘導的心臟重構[1-3]。我們前期研究發現，Rut通過抑制MAPK/ERK信號傳導對壓力負荷型心肌肥厚的發生具有抑制作用[4]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是內皮細胞分泌的舒張血管的重要活性物質，其水平或活性下調也參與了心肌肥厚的形成[5]。Xu等[6]的研究發現，Rut通過促進一氧化氮(nitric oxide,NO)生成，對大鼠頸動脈內膜增生有抑制作用。那么，除了上述信號通路，NO是否也參與了Rut的抗心肌肥大作用？這是值得深入研究的問題。

本實驗擬采用乳鼠原代心肌細胞培養，研究Rut對血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)誘導心肌細胞肥大的作用，并探討NO在其中的作用，以期為Rut的進一步研發應用提供基礎藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 Rut(純度為98%，南京澤郞科技有限公司，批號：20110934)；Ang Ⅱ(Anaspec公司)；胰蛋白酶(生工生物工程有限公司)；DMEM干粉(GIBCO公司)；標準胎牛血清(天津灝洋生物品科技有限公司)；RIPA裂解液、NO和一氧化氮合成酶(NO synthase,NOS)檢測試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PCR引物由大連寶生物工程有限公司負責設計及合成；其它試劑均為國產分析純。

1.1.2 動物 SD大鼠種鼠30只，清潔級，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。合格證書號SCXK(渝)2007-0009。飼養和實驗過程嚴格遵守遵義醫科大學實驗動物管理與倫理的有關準則。

1.1.3 儀器 IX73熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；5417R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Multiscan全波長酶標儀(美國Thermo公司)；Nanodrop微量分光光度計(美國Thermo公司)；實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)；4000B細胞圖像分析系統(德國Leica公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞培養及分組 用胰蛋白酶消化法將1～3 d齡乳鼠心室肌消化成單細胞懸液，差速貼壁分離1.5 h，將未貼壁心肌細胞用含20%胎牛血清的DMEM懸浮，調不同細胞密度分別接種于6孔板(用于細胞直徑測量，總蛋白提取和檢測)或T25培養瓶內(用于RNA提取及檢測)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。18～30 h后見細胞貼壁生長，48 h細胞出現自發搏動。培養初始48h加入5′-BrdU 0.1 mmol/L抑制非心肌細胞生長，然后更換培養液繼續培養24 h，至72 h換無血清培養液并加入相應藥物，繼續孵育48 h后用于檢測。分組如下：①空白組：等體積PBS液；② Ang Ⅱ 組：0.1 μmol/L；③④⑤ Ang Ⅱ + Rut(0.1、1.0、10 μmol/L)組。

1.2.2 心肌細胞直徑測量 取有心肌細胞生長的玻片，預冷D-Hank′s 液漂洗，4%多聚甲醛固定15 min，晾干，常規HE染色，用細胞圖像分析系統測量單個細胞最大直徑，每張玻片測5個視野，每個視野測10～15個細胞，取其平均值。每組重復4次。

1.2.3 心肌細胞總蛋白測定 將6孔板內培養好的心肌細胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分攪動裂解5 min后轉至EP管中，超聲破碎3min，存放于-80 ℃。BCA法測定總蛋白含量，并根據接種細胞數目來計算心肌細胞的蛋白含量。每組重復4次。

1.2.4 NO含量和NOS活性檢測 取加藥孵育48 h后的無血清培養基100 μL，按照NO和NOS測定試劑盒說明書操作，測定NO含量和NOS活性。并根據試劑盒提供的方法計算NO含量和NOS活性，NO根據標準曲線計算含量，總NOS活力(kU/L)=(總NOS活力測定管A-空白管A)×26.1/0.383×1.5。

1.2.5 Real time RT- PCR檢測心肌細胞心房利鈉因子(atrial natriuretic factor，ANF)以及內皮型NOS (endothelial NOS,eNOS)的mRNA表達 各組細胞均以3×106/mL密度接種于T25培養瓶內，Rut組加入Rut(0.1、1.0、10 μmol/L)，培養48 h后，按照Trizol試劑盒說明書提取心肌細胞總RNA，測定濃度后按逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄為 cDNA 并稀釋，進行PCR擴增，擴增條件如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環。以β-actin為管家基因，采用 2-ΔΔCt法計算ANF，eNOS mRNA的相對表達水平。

表1引物序列

名稱GenBank序列號引物系列 (5′-3′)擴增片段(bp)ANFNM 012612F-TGACAGGATTGGAGCCCAGAG75R-TCGAGCAGATTTGGCTGTTATCTTCeNOSNM 021838F-AGCTGGATGAAGCCGGTGAC164R-CCTCGTGGTAGCGTTGCTGAβ-actinNM 031144F-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA150R-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG

2 結果

2.1 Rut對Ang Ⅱ誘導心肌肥大的影響 細胞形態學檢測可見，加入Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)后，心肌細胞明顯增大(見圖1)，細胞直徑、總蛋白含量明顯增加，ANF mRNA表達增加(P<0.05)(見表2)，提示心肌細胞肥大。以平均值計算，Ang Ⅱ處理后，細胞直徑增加了約1.0倍，蛋白含量增加了19.1%，ANF mRNA表達增加2.8倍；與單獨給予Ang Ⅱ比較，Rut(0.1、1、10 μmol/L)劑量依賴的抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞直徑增大和總蛋白含量的增加，其抑制率分別為5.1%、13.9%、26.0%(P<0.05)和11.7%、12.9%、14.9%(P<0.05)；且下調Ang Ⅱ誘導的ANF mRNA的表達，分別下調36.3%、43.6%和47.7%(P<0.05)。

A：空白組；B:AngⅡ(1.0 μmol/L)；C:AngⅡ+Rut(0.1 μmol/L)；D:AngⅡ+Rut(1.0 μmol/L)；E:AngⅡ+Rut(10 μmol/L)。圖1 吳茱萸次堿(Rut)對Ang Ⅱ誘導心肌細胞肥大的影響(×400)

組別心肌細胞直徑(μm)蛋白含量(pg)ANF mRNA空白52.4±5.6100.6±4.4100.0±6.1Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)106.6±8.8#119.8±0.7# 286.2±25.1#Rut(0.1 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)101.2±6.4105.8±1.1? 182.4±20.2?Rut (1 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)91.8±7.0?104.4±1.9?161.3±5.8?Rut(10 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)78.9±5.7?101.9±1.2?149.6±6.9?

#：與空白組比較，P<0.05；*：與Ang Ⅱ組比較，P< 0.05。

2.2 Rut對Ang Ⅱ誘導心肌肥大中NO含量和NOS活性的影響 加入Ang Ⅱ后，培養心肌細胞上清液中NO含量和NOS活性顯著降低，分別減少了72.7%和42.1% (P<0.01)；Rut明顯升高Ang Ⅱ所減少的NO含量和NOS活性水平(P<0.05)，結果見表3。

組別NO含量(μmol/L)NOS活性(kU/L)空白4.62±0.364.01±0.54Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)1.26±0.51##2.32±0.24##Rut (0.1μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)2.91±0.42?2.83±0.08Rut (1.0μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)3.35±0.33?3.20±0.07?Rut (10 μmol/L)+Ang Ⅱ (1.0 μmol/L)4.13±0.25?4.03±0.78?

##：與空白組比較，P<0.01；*：與Ang Ⅱ組比較，P<0.05。

2.3 Rut對Ang Ⅱ誘導的肥大心肌細胞中eNOS mRNA表達的影響 Real time RT-PCR檢測結果顯示，與對照組比較，Ang Ⅱ明顯降低eNOS mRNA的表達(P<0.05)。與Ang Ⅱ組比較，Rut中、高劑量組明顯升高eNOS mRNA表達(P<0.05)(見表4)。

組別eNOS mRNA空白146.12±29.36Ang(1.0 μmol/L)47.26±19.08#Rut(0.1μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)58.21±18.05Rut(1.0 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)82.30±21.11?Rut(10 μmol/L)+Ang Ⅱ(1.0 μmol/L)125.63±26.07?

#：與空白組比較，P<0.05；*：與Ang Ⅱ組比較，P<0.05。

3 討論

心肌肥大是心血管疾病發生發展的獨立危險因素之一，目前抑制心肌肥厚的藥物主要有利尿藥、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑和鈣拮抗劑等，但療效不夠理想，相關藥物的研發一直是心血管疾病防治領域的研究熱點和難點[7-8]。NO是血管內皮合成的舒血管物質，血管內皮細胞釋放NO后，激活鳥苷酸環化酶，cGMP生成增加，血管舒張。當各種因素刺激或作用，NO生成減少或降解增加，血管平滑肌細胞中NO水平下降，血管舒張效應減弱，從而增強縮血管物質的作用，血管長期處于收縮狀態，血壓升高，心臟后負荷增加，通過不同信號通路作用，最終導致心肌肥厚[9]。因此，促進NO含量升高的藥物具有保護心肌肥厚的作用。

Rut是傳統中藥吳茱萸的主要活性成分之一，具有利尿、抗血小板聚集、舒張血管、抑制環氧酶-2等多種生物活性[10-11]。本實驗室前期研究發現，Rut抗血管平滑肌細胞增殖作用與其促進NO釋放有關[12]，但對于Rut心肌肥厚保護作用與NO之間的關系目前未見報道。本研究中，Ang Ⅱ作用48 h后，心肌細胞NO含量明顯減少，NOS活性明顯降低；同時，心肌細胞的直徑、蛋白質含量、ANF mRNA表達及形態學改變均提示心肌細胞出現肥大的病理改變。這些結果提示，NO釋放減少參與了心肌肥大的形成發展過程。Rut抑制心肌肥大改變同時，使NO水平明顯增高，提示Rut具有抗心肌細胞肥大作用，該作用可能與其增加NO含量有關。由于Rut作用廣泛，其促進NO釋放作用可能涉及多種信號通路，故尚需進行深入研究。