蛛網膜下腔注射阿霉素對家兔運動及感覺功能的影響

袁 杰，王斯瑋，余守洋，姚 剛

(1.遵義醫科大學附屬醫院 疼痛科暨麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫科大學附屬口腔醫院 種植科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫科大學 麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563099；4.安順市人民醫院 疼痛科，貴州 安順 561000)

阿霉素(adriamycin,ADM)是一種臨床常用抗腫瘤抗生素，有較強的細胞毒性和神經毒性。阿霉素能損害周圍神經系統的神經元，尤其是脊髓背根神經節(Dorsal root ganglion,DRG)和自主神經節神經元[1]。目前臨床常用于損毀神經節來治療三叉神經痛、帶狀皰疹后遺神經痛等神經病理性疼痛[2]。近幾年的研究發現阿霉素可選擇性地對神經節細胞產生不可逆變性、壞死作用[3-4]。但蛛網膜下腔注射阿霉素是否會對肢體感覺和運動功能產生影響仍有待進一步研究。據此，本實驗的主要目的是觀察在蛛網膜下隙注射0.4 mL阿霉素后，觀察阿霉素對家兔后肢運動及感覺功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與儀器 阿霉素(分子量543.52，萬樂藥業，深圳)；蒸餾水(Millipore，美國)；JL-F光熱測痛儀(2411013，明克斯儀器，上海)；生物光學顯微鏡(BX43，Olympus，日本)；小動物手術器械包(SP0004-M，瑞沃德，深圳)；全自動熱痛刺激儀(BME-410C，凱輝盛達科技發展有限公司，北京)、電子測痛儀(Electronic Von Frey，IITC公司，美國)。

1.2 實驗動物 健康成年雄性家兔24只，SPF級，體重1.5～2 kg，由第三軍醫大學動物實驗中心提供[許可證號：SCXK(渝)2012-0005]。所有動物均飼養于遵義醫科大學“貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室”SPF級動物房。動物房內室溫維持在22～25 ℃，08∶00～20∶00開燈，20∶00～次日08∶00關燈，動物可自由獲得標準化飲食和飲水。動物飼養和操作遵循世界動物保護協會和國際疼痛研究學會相關規定，并獲得遵義醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1 分組 將家兔隨機分為2組，每組6只，NS組：蛛網膜下腔注射生理鹽水(0.4 mL)； ADM組：蛛網膜下腔注射濃度為1%的阿霉素(0.4 mL)。

1.3.2 后肢運動和感覺功能評價

1.3.2.1 后肢運動功能評價 術前及術后1～8周每周評價后肢運動功能[1]。在寬闊場地觀察家兔自發活動。0級：無后肢運動，無負重；1級：幅度微弱的后肢運動，無負重；2級：后肢較強有力,有輕微運動,無負重；3級：后肢可負重，可行走1至2步；4級：輕微跛行；5級：正常行走。

1.3.2.2 后肢感覺功能評價 機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold， MWT):將家兔置于底部均勻分布大小0.5 cm × 0.5 cm孔徑的透明玻璃籠中。適應30 min后，利用von Frey測痛儀垂直刺激家兔左后肢足掌部，刺激力度以von Frey絲輕微彎曲為準，持續5 s或直至出現縮足反應。出現縮足反應記為陽性，否則視為陰性。采用up-and-down法[5]計算50%縮足閾值(MWT)，縮足閾值=最大值-(最大值-最小值)/[最大值×(最大百分比-50%)]。測定時間為阿霉素注射前1周至注射后8周，每天上午08∶00-10∶00。

熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)：參照之前文獻報道的方法[6]，家兔適應環境30 min后，使用熱痛刺激儀，輻射熱對準小鼠左足掌正中照射，自動記錄縮足反應的潛伏期作為熱痛閾。每只家兔測定3次，取3次平均值作為熱痛縮足閾值(TWL)。測定時間為每天下午15∶00～17∶00。所有觀察和記錄均在雙盲條件下進行。

2 結果

2.1 ADM蛛網膜下腔注射對家兔運動功能的影響 與注射前比較，家兔在注射生理鹽水1和2周后，分別有25%(3/12)和16.7%(2/12)出現輕微跛行。阿霉素注射1和2周后，分別有33%(4/12)和25%(3/12)出現輕微跛行。1和2周出現跛行的陽性率兩組間無統計學差異(P>0.05)。3～8周兩組家兔后肢運動功能未見異常(見表1)。

表1家兔后肢出現跛行的陽性率

組別后肢跛行陽性率注射前注射后1周注射后2周 NS03(25%)?2(16%)?ADM04(33%)#3(25%)#

*：與NS組注射前比較，P<0.05；#：與ADM注射前比較，P<0.05。

2.2 ADM蛛網膜下腔注射對家兔MWT的影響 2組家兔MWT基礎閾值比較無統計學差異(P>0.05)。生理鹽水組注射前后，MWT值無統計學差異。與注射前對比，ADM組注射后1、2、3周MWT值明顯降低(P<0.05)，4～8周MWT值明顯增加(P<0.05，見表2)。

2.3 ADM蛛網膜下腔注射對家兔TWL的影響 2組家兔TWL基礎閾值無統計學差異(P>0.05)。生理鹽水組注射前后，TWL值無統計學差異(P>0.05)。同上，ADM組注射后1、2、3周TWL值明顯降低(P<0.05)，4～8周TWL值明顯增加(P<0.05，見表3)。

表2家兔蛛網膜下腔注射生理鹽水或阿霉素前后的MWT變化

組別基礎痛閾術后1周術后2周術后3周術后4周NS43.89±3.4241.48±4.7742.79±3.2741.91±3.9439.88±3.39ADM42.73±4.2727.43±3.64?#29.33±4.39?#26.96±4.38?#62.74±3.77?#續表組別基礎痛閾術后5周術后6周術后7周術后8周NS43.89±3.4242.49±3.2141.53±2.9642.58±3.7741.43±4.27ADM42.73±4.2764.33±4.29?#61.27±3.25?#59.57±4.29?#2.44±4.21?#

*：ADM與注射前比較，P<0.05；#：ADM與NS組比較，P<0.05。

表3家兔蛛網膜下腔注射生理鹽水或阿霉素前后的TWL變化

組別基礎痛閾術后1周術后2周術后3周術后4周NS18.32±3.8717.43±2.4519.23±3.1117.85±4.4519.51±2.49ADM19.61±2.999.34±4.89?#8.32±3.74?#11.47±3.92?#39.33±3.51?#續表組別基礎痛閾術后5周術后6周術后7周術后8周NS18.32±3.8717.83±2.8718.45±2.9220.27±3.3719.73±3.48ADM19.61±2.9942.69±3.59?#41.67±3.54?#39.98±2.98?#41.62±4.39?#

*：ADM與注射前比較，P<0.05；#：ADM與NS組比較，P<0.05。

3 討論

阿霉素可抑制RNA和DNA的合成，具有較強的細胞毒性和神經毒性[7]。是近年來廣泛用于治療三叉神經痛等神經病理性疼痛的一種神經毀損藥物。目前的研究認為，阿霉素主要通過兩種途徑對組織細胞造成損傷：①促進有害羥自由基的產生及膜脂質過氧化；②能嵌入DNA堿基對，通過阻止轉錄過程，抑制RNA合成，從而阻止DNA的復制[8]。此外，阿霉素可被神經纖維末梢吸收并沿軸漿逆行性運輸(lethal retrograde axoplasmic transport)和自殺性運輸(suicide transport)[9]。阿霉素還對背根神經節(DRG)有較高的親和性[10]，前期研究發現脊髓前角運動神經元對阿霉素的敏感性和易損性不同于DRG，并且小劑量的阿霉素還對DRG具有選擇性破壞作用[11]。

本實驗后肢運動功能檢測結果顯示，家兔蛛網膜下腔注射生理鹽水1和2周后，分別有25%(3/12)和16%(2/12)的家兔出現跛行。注射阿霉素后1周和2周后，分別有33.3%(4/12)，25%(3/12)的家兔出現跛行。注射生理鹽水及阿霉素后跛行陽性率較于注射前出現明顯差異(P<0.05)，NS組和ADM組比較陽性率未見明顯差異(P>0.05)。據此，我們認為注射1～2周后造成的跛行與阿霉素注射沒有相關性，可能是蛛網膜下腔注射對局部肌肉組織造成的創傷所導致。

本實驗感覺功能實驗結果顯示，家兔蛛網膜下腔注射生理鹽水后，1～8周機械縮足閾值(MWT)未見明顯差異(P>0.05)；注射阿霉素后，1～3周MWT明顯低于注射前，4～8周明顯高于注射前。家兔蛛網膜下腔注射生理鹽水后，1～8周熱縮足潛伏期(TWL)未見明顯異常(P>0.05)；注射阿霉素后，1～3周TWL明顯低于注射前，4～8周明顯高于注射前。實驗表明，注射阿霉素1～3周，家兔后肢MWT及TWL值均出現明顯降低，可能與DRG細胞受損初期出現興奮性增強及痛覺過敏有關[12]。注射阿霉素后4～8周，MWT及TWL值出現明顯增高，表明阿霉素蛛網膜下腔注射可能導致了DRG壞死。家兔在蛛網膜下腔注射阿霉素4周后出現痛閾值升高，可能與DRG細胞壞死需要一定的時間有關。之前的病理實驗報道了注射后4周DRG細胞出現明顯壞死[13-14]，我們的感覺功能檢測結果與病理實驗相符。這一結果提示蛛網膜下腔注射阿霉素治療頑固性的神經病理性疼痛時，常需要4周以上的時間才能判斷阿霉素注射的鎮痛效果，應避免在短時間內重復多次注射。

DRG是軀體和內臟感覺的重要傳入通路，在多種神經病理性疼痛的發生和維持過程中扮演關鍵的角色。我們的研究證實，家兔選擇性的損毀相應節段的DRG，后肢痛閾在注射4周后明顯增高，而運動功能不受影響。阿霉素蛛網膜下腔注射可達到化學切除DRG的目的，這一方法較于外科手術切除DRG，可減少手術伴隨的并發癥[15]。這一方法有望對臨床治療頑固性病理性神經病理性疼痛提供一新思路。