雌激素對(duì)小腸葡萄糖吸收的調(diào)節(jié)及機(jī)制研究

陳長(zhǎng)梅，杜 倩，謝 睿，徐靖宇，陳遠(yuǎn)壽

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,貴州 遵義 563099)

肥胖是21世紀(jì)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生流行病之一，目前已經(jīng)成為全球性問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)：絕經(jīng)后女性與絕經(jīng)前相比，前者患肥胖的可能性增加三倍[1]。據(jù)美國(guó)膽固醇教育計(jì)劃成人治療組第三次調(diào)查報(bào)告顯示，60歲以前女性肥胖的發(fā)病率普遍低于男性，在60～69歲時(shí)發(fā)病率迅速上升，到70歲以上女性肥胖的發(fā)病率已經(jīng)明顯超過(guò)同齡男性[2]。2009年關(guān)于北京市成年女性絕經(jīng)前后肥胖發(fā)病情況分析結(jié)果顯示，女性在50歲之前發(fā)病率顯著低于男性，從50歲開始肥胖發(fā)病率(顯著)升高迅速，開始超過(guò)男性[3]。以上研究提示雌激素減少與女性肥胖的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

鈣離子主要通過(guò)與鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor，CaSR)結(jié)合后產(chǎn)生作用。CaSR是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)，是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)鈣離子平衡的主要受體，其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)參與了多種途徑影響腸道運(yùn)動(dòng)。例如：調(diào)節(jié)胰高血糖素樣肽1(Glucagon-likepeptide1,GLP-1)、酪酪肽(Peptide tyrosine tyrosine，PYY)以及抑胃肽等腦腸肽的釋放，以維持機(jī)體能量及葡萄糖代謝平衡[4-5]。但是目前有關(guān)雌激素-鈣敏感受體與葡萄糖吸收之間的相互關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，在本項(xiàng)目中，我們研究在雌激素分泌缺失情況下，CaSR在小鼠十二指腸的表達(dá)，及其在十二指腸葡萄糖吸收中的作用，為研究雌激素對(duì)肥胖的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 4周齡SPF級(jí)C57雌鼠(重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院動(dòng)物中心提供)，選擇性成熟期(6周齡)C57雌鼠36只在全麻下進(jìn)行假手術(shù)和去卵巢，把18只去卵巢雌性C57小鼠作為去卵巢組，18只假手術(shù)雌性C57小鼠作為假手術(shù)組。卵巢切除手術(shù)步驟：術(shù)前12 h 禁食不禁飲，按80mg/kg體重的劑量給予小鼠腹腔注射濃度為0.5%戊巴比妥鈉。小鼠麻醉后行背部切口，分離組織找到呈粉紅色桑葚樣卵巢，切除卵巢止血后把輸卵管還納入腹腔，縫合切口并涂抹金霉素眼膏，術(shù)后保暖以促進(jìn)小鼠復(fù)蘇，每天涂藥以防止切口感染，待小鼠傷口完全愈合。手術(shù)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑 CaSR (ab19347)和β-actin單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司、封閉蛋白干粉購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司、鼠二抗購(gòu)自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司和兔二抗購(gòu)自艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司、免疫組化試劑盒購(gòu)于北京博奧森生物公司，EVC4000、Ussing Chamber(美國(guó)WPI公司)，雌二醇檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸鉀、碳酸氫鈉、K2HPO4及 KH2PO4均購(gòu)自Sangon Biotech公司，Glycine與Tris購(gòu)自Biofroxx公司，SDS購(gòu)自Solarbio公司。

1.3 Ussing chamber實(shí)驗(yàn)

1.3.1 工作液配制 粘膜側(cè)工作液：用量筒分別量取配置好的儲(chǔ)備液2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L 葡萄糖酸鈉溶液、0.104 mol/L葡萄糖酸鉀溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2各25 mL混勻，稱取0.911g甘露醇加入上述混合液中(終濃度為10 mmol/L)，最后用超純水定容至500 mL，用100% O2充氣1 h至溶液澄清后4℃存儲(chǔ)備用。

漿膜側(cè)工作液：用量筒分別量取2.3 mol/L NaCl溶液、0.5 mol/L NaHCO3溶液、44 mmol/L K2HPO4/16 mmol/L KH2PO4溶液、24 mmol/L MgCl2溶液、24 mmol/L CaCl2溶液各25 mL混勻，稱取0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)加入上述混合液中(終濃度10 mmol/L)，加超純水定容至500 mL，用混合氣體(95%O2+5%CO2)充氣1 h至溶液澄清4 ℃存儲(chǔ)備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)裝置準(zhǔn)備 在U型裝置內(nèi)加入電解質(zhì)緩沖液，U型管外套中循環(huán)流動(dòng)著恒溫37 ℃的水浴，以確保腸組織能夠處于合適的溫度環(huán)境中，并對(duì)電壓電極和液體阻抗進(jìn)行補(bǔ)償，約20 min左右。預(yù)調(diào)完成后拆開小室，用三蒸水清除U型管中的電解液。

1.3.3 標(biāo)本制備與檢測(cè)

1.3.3.1 取手術(shù)后2周的C57雌鼠，禁食1 h以上，采用斷頸法將小鼠處死，取出小鼠遠(yuǎn)端十二指腸(約2 cm)和上段空腸(約2 cm)，立即放入含有1μM消炎痛的4 ℃等滲甘露醇溶液中，將腸段放置在表面放置了封口膜的平整的石蠟塊上，并用上述等滲甘露醇溶液將腸管淹沒，沿著腸系膜將腸管切開，剝離掉漿膜及肌層組織，將粘膜及粘膜下層組織固定在chamber上(有效滲透面積為0.16 cm2)，然后組裝上chamber，粘膜側(cè)(頂端側(cè))加入10 mL粘膜側(cè)工作液,并給予連續(xù)的、均勻的100%氧氣灌注；漿膜側(cè)(基底側(cè))加入10 mL漿膜側(cè)工作液，并給予連續(xù)的、均勻的95%氧氣+5%二氧化碳混合氣體灌注，裝上組織后每隔5 min記錄一次短路電流(short-circuit current，Isc)，穩(wěn)定15 min后，分別在粘膜側(cè)、漿膜側(cè)或者漿膜側(cè)和粘膜側(cè)予以不同的鈣通道阻斷劑預(yù)處理，繼續(xù)觀察15 min，然后在粘膜側(cè)加入20 mM葡萄糖溶液，繼續(xù)觀察30 min并記錄Isc，然后對(duì)短路電流差值(ΔIsc)進(jìn)行比較，ΔIsc是裝上組織后觀察30 min加試劑處理后的峰值減去基值，基值是裝上組織后觀察30 min時(shí)的Isc值，ΔIsc值越高，葡萄糖吸收越多；反之亦然。

1.3.3.2 取6周齡正常C57雌鼠，按上述方法制備十二指腸和上段空腸粘膜及粘膜下層組織滲透膜進(jìn)行Ussing chamber實(shí)驗(yàn)，以chamber工作液不加入EGTA及NPS-2143作為正常組，chamber工作液加入EGTA和/或NPS-2143作為實(shí)驗(yàn)組，裝上組織滲透膜后每隔5 min記錄1次短路電流(short-circuit current,Isc)，穩(wěn)定15 min后，分別在粘膜側(cè)、漿膜側(cè)或者漿膜側(cè)和粘膜側(cè)予以Ca2+螯合劑或CaSR特異性抑制劑預(yù)處理，繼續(xù)觀察15 min，然后在粘膜側(cè)加入20 mM葡萄糖溶液，繼續(xù)觀察30 min并記錄Isc，然后對(duì)短路電流差值(△Isc)進(jìn)行比較。

1.4 血清中雌二醇檢測(cè)方法 經(jīng)腔靜脈抽血，運(yùn)用放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)測(cè)定雌二醇水平。測(cè)定原理：采用均相競(jìng)爭(zhēng)原理，即標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)血品中的E2和一定量的125I-E2共同與限量的E2抗體在適宜條件下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)，一部分與抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，而另一部分，呈游離狀態(tài)125I-E2與抗體結(jié)合的比例取決于標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)樣品中非標(biāo)記E2的含量，非標(biāo)記E2的含量越高，125I-E2與抗體結(jié)合的比例越小；非標(biāo)記E2的含量越少，125I-E2與抗體結(jié)合的比例越大。用免疫分離試劑(PR)將結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離后，測(cè)定結(jié)合部分的放射性活度，并計(jì)算相應(yīng)結(jié)合率B/B6。用已知標(biāo)準(zhǔn)E2含量與對(duì)應(yīng)結(jié)合率作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查知對(duì)應(yīng)結(jié)合率的樣品中E2的含量。標(biāo)準(zhǔn)范圍：5～4 000 pg/mL。

1.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western-blot)檢測(cè)CaSR的蛋白水平 取假手術(shù)組及去卵巢組小鼠小腸組織，依次加入100 μL裂解液(PMSF和RIPA按照1∶100體積比混合)進(jìn)行細(xì)胞裂解，4 ℃，12 000×g離心10 min，吸取蛋白上清溶液，保存于-80 ℃。用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。在80 V恒壓條件下電泳，肉眼觀察溴酚藍(lán)到達(dá)距離玻璃板底時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉：5%牛血清白蛋白，室溫反應(yīng)2 h。一抗結(jié)合：加入一抗(CaSR按照1∶2 000稀釋)，在4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。二抗結(jié)合：放在1∶2 000倍稀釋的二抗中，室溫孵育2 h。顯色，曝光后，用ImageJ對(duì)蛋白進(jìn)行定量分析，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)兩組小鼠的血清雌二醇水平 小鼠血清中雌二醇水平測(cè)定結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠血清雌二醇水平為(175.74±145.56 pg/mL，n=10)，去卵巢組小鼠血清雌二醇水平為(13.12±5.14 pg/mL，n=10)，與假手術(shù)組小鼠相比，去卵巢組小鼠血清雌二醇水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 Ussing chamber檢測(cè)葡萄糖在小腸吸收的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：去卵巢組葡萄糖吸收升高明顯引起ΔIsc的變化(n=5，P<0.05，vs假手術(shù)組)(見圖1)。

A：Isc檢測(cè)結(jié)果；B：葡萄糖刺激前后ΔIsc的比較(n=5，與假手術(shù)組相比，*：P<0.05)。圖1 雌激素不同水平對(duì)小鼠小腸葡萄糖吸收的ΔIsc變化

2.3 Western-Blot檢測(cè)兩組小鼠小腸CaSR蛋白的表達(dá) Western-Blot結(jié)果顯示：假手術(shù)組及去卵巢組小鼠小腸上皮組織均有CaSR蛋白表達(dá)，與假手術(shù)組相比去卵巢組小鼠小腸上皮組織CaSR蛋白表達(dá)減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如圖2所示，提示雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致十二指腸CaSR表達(dá)的降低。

A：Western-Blot檢測(cè)結(jié)果；B：CaSR蛋白相對(duì)表達(dá)量分析假手術(shù)組與去卵巢組小鼠十二指腸CaSR的表達(dá)(n=4，與假手術(shù)組相比，*：P<0.05)。圖2 Western-Blot檢測(cè)各組小鼠小腸CaSR的表達(dá)

2.4 Ca2+螯合劑、CaSR特異性抑制劑對(duì)葡萄糖吸收的影響 分別在粘膜側(cè)、漿膜側(cè)、粘膜與漿膜雙側(cè)均加入EGTA(0.1 mM)及NPS-2143(30 mM)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)漿膜側(cè)加EGTA(n=6，P<0.05vs正常組)和雙側(cè)加EGTA(n=6，P<0.05vs正常組)均明顯抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化，而粘膜側(cè)加EGTA不改變葡萄糖吸收引起的ΔIsc(n=6，P>0.05vs正常組)(見圖3A、3C)；(2)漿膜側(cè)加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常組)和雙側(cè)加NPS-2143(n=6，P<0.05vs正常組)均抑制葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化，而粘膜側(cè)加NPS-2143不改變葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化(n=6，P>0.05vs正常組)(見圖3B、3D)。

A：加入EGTA后的Isc變化；B：加入NPS后的Isc變化；C：加入EGTA后的ΔIsc變化；D：加入NPS后的ΔIsc變化(n=6，與正常組相比，*：P<0.05)。圖3 加入EGTA和NPS-2143后葡萄糖吸收的ΔIsc變化

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，肥胖發(fā)生率迅速上升，與絕經(jīng)前女性相比，絕經(jīng)后女性肥胖發(fā)生率增加了3倍[2-3]，提示雌激素分泌減少可能是導(dǎo)致女性絕經(jīng)后肥胖比率增高的主要原因。

我們團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)雌激素能夠參與調(diào)節(jié)十二指腸粘膜上皮細(xì)胞的氯離子、碳酸氫鹽及鈣離子的分泌[6-7]。在早期的研究中，Ghijsen等[8]在切除了卵巢的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)手術(shù)組小鼠血清雌激素水平明顯下降，進(jìn)而導(dǎo)致小腸Ca2+吸收減少。我們的研究證實(shí)了Ghijsen等的研究成果，發(fā)現(xiàn)去卵巢組葡萄糖吸收引起的ΔIsc變化明顯高于假手術(shù)組，提示雌激素可能參與小腸葡萄糖吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程與雌激素分泌高低密切相關(guān)。最近一項(xiàng)研究[9]發(fā)現(xiàn)，去卵巢會(huì)引起大鼠甲狀旁腺中CaSR的表達(dá)量顯著降低，而預(yù)防性注射β-雌二醇會(huì)使甲狀旁腺中CaSR的表達(dá)量顯著升高，提示雌激素可以調(diào)節(jié)甲狀旁腺中CaSR的表達(dá)。本研究證實(shí)，在卵巢切除后的小鼠中，小腸上皮組織中CaSR的表達(dá)相對(duì)于在正常小腸上皮組織中的表達(dá)明顯降低，這一結(jié)果提示雌激素分泌缺乏能影響小鼠小腸上皮CaSR的表達(dá)。

眾所周知，CaSR最早是1993年從牛甲狀旁腺中克隆和分離出來(lái)的，是G蛋白偶聯(lián)家族中的成員之一，主要包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)三個(gè)獨(dú)立的區(qū)域[10]。CaSR激活后，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣活化，從而激活胞內(nèi)下游信號(hào)通路，發(fā)生相關(guān)生物學(xué)行為[11]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，CaSR位于甲狀旁腺細(xì)胞表面，能夠感應(yīng)細(xì)胞外Ca2+濃度的細(xì)微變化，從而快速調(diào)控甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)的分泌，同時(shí)，雌激素也能通過(guò)相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞受體系統(tǒng)影響PTH的表達(dá)及分泌[12]。1993年，Mckane等的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致腸鈣吸收降低，PTH分泌增多，進(jìn)而影響CaSR的表達(dá)[13]。有文獻(xiàn)報(bào)道，鈣離子參與小腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)行為，其主要來(lái)源是漿膜側(cè)鈣流入[14]，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，CaSR在小腸粘膜側(cè)及漿膜側(cè)均有表達(dá)，但主要表達(dá)在漿膜側(cè)[15]。目前，有關(guān)CaSR與葡萄糖吸收之間的研究還鮮有報(bào)道。為了證實(shí)CaSR在小腸上皮組織葡萄糖中的調(diào)節(jié)作用，我們運(yùn)用Ca2+螯合劑EGTA及CaSR阻斷劑NPS-2143進(jìn)行Ussing chamber實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入EGTA及NPS-2143后，葡萄糖介導(dǎo)的ΔIsc顯著降低，提示鈣敏感受體及其介導(dǎo)的鈣信號(hào)可能參與了葡萄糖的吸收。但是目前還沒有證據(jù)直接證實(shí)鈣敏感受體及其鈣信號(hào)直接參與葡萄糖的吸收，那么鈣敏感受體及其介導(dǎo)的鈣信號(hào)是如何參與調(diào)控葡萄糖吸收的呢？有文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄糖的吸收主要依靠頂端細(xì)胞膜上Na+/葡萄糖同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Sodium-dependent glucose transporters 1，SGLT1)及基底細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose transporter 2，GLUT2)介導(dǎo)[16]。隨著腸腔葡萄糖濃度升高，葡萄糖與鈉離子經(jīng)由細(xì)胞膜上的SGLT1共同轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸粘膜上皮細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，使Cav1.3通道開放，促使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加激活了細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase ，MLCK)，從而使終末網(wǎng)周圍鏈接肌球蛋白環(huán)上肌球蛋白輕鏈Ser19磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周圍連接肌動(dòng)蛋白環(huán)收縮及細(xì)胞骨架重排，導(dǎo)致GLUT2從終末網(wǎng)順利易位到小腸粘膜上皮細(xì)胞頂膜而參與葡萄糖吸收[17-18]。除此以外，激活鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)與鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶β(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ CaMKKβ)[19]。CaMKKβ使腺苷酸激活蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)和AMPK下游的酰基輔酶A羧化酶(acyl coenzyme A carboxylase， ACC)磷酸化，從而激活A(yù)MPK[20-21]。有研究報(bào)道，激活的AMPK通過(guò)參與調(diào)節(jié)小腸粘膜上皮細(xì)胞頂膜上GLUT2 和(或)SGLT1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)小腸道葡萄糖的吸收[22-23]。因此我們有理由認(rèn)為，CaSR介導(dǎo)的鈣信號(hào)也參與了對(duì)GLUT2 和(或)SGLT1的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響了葡萄糖的吸收。

綜上所述，我們的結(jié)果首次證實(shí)了雌激素對(duì)小腸葡萄糖吸收的影響，即雌激素分泌減少可以促進(jìn)小腸對(duì)葡萄糖的吸收，并且這一過(guò)程主要是通過(guò)調(diào)節(jié)對(duì)CaSR在小腸上皮細(xì)胞上的表達(dá)及功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這為我們進(jìn)一步研究女性絕經(jīng)后肥胖的發(fā)生提供了新的理論基礎(chǔ)。