豬圓環病毒3型夾心ELISA診斷方法的建立

于俊楠 陳 媛 彭堯舜 金宜順 羅莉妍 陳梅芳

(福建農林大學動物科學學院 福州 350002)

豬圓環病毒3型 （Porcine circovirus serum type 3，PCV3）是新發現的圓環病毒，二十面體結構，無囊膜，直徑17～20 nm[1]。2016年在美國首先報道該病毒的存在[2-3]，隨后陸續有報道顯示PCV3型病毒也廣泛存在我國境內[4]。綜合國內外報道，該病毒與心臟和多系統疾病、豬皮炎腎炎綜合征、繁殖障礙類 疾病存在密切聯系[2-3,5]。PCV3和PCV2衣殼蛋白Cap同源性僅為30%左右[6]，現有的PCV2疫苗無法對PCV3進行有效防控，PCV3對生豬養殖所造成的損失進一步加大，有效地檢測場內的PCV3感染率是對其進行防治的首要任務。

ELISA方法是市場應用面極大的一項血清學診斷技術，其原理簡單，操作簡便、靈敏、快速，適用于大量樣品的檢測，從抗原性和結構上可知，PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護的特性。Cap蛋白作為PCV3的主要抗原性攜帶的結構蛋白，使其成為在血清學上檢測PCV3的理想抗原。為滿足生產上大批量、低成本、快速的檢測需求，本研究將重組PCV3 Cap蛋白的單克隆抗體作為包被抗體，以抗Cap蛋白兔多抗為檢測抗體，優化反應條件構建檢測PCV3的夾心ELISA方法。測試該方法的特異性、敏感性和重復性以實現預期的目標。臨床檢測結果良好，該診斷方法的建立對于PCV3的快速診斷具有很大意義。

1 材料與方法

1.1 病毒、試劑、儀器 已純化的PCV3重組Cap蛋白（18 μg/mL）、PCV3 Cap 蛋白單克隆抗體由本實驗室制備保存，豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）及 PCV2 Cap 蛋白均由實驗室制備保存；新西蘭黃兔從福建農林大學兔園購買；碳酸鹽緩沖液（PBS）購買自武漢賽威生物技術有限公司；Tween-20購自國藥集團化學試劑有限公司；ELISA相關試劑、羊抗兔HRP-IgG、酶標板均購自北京索萊寶科技有限公司；MultiskanGo新一代全波長酶標儀（Thermo）。

1.2 單克隆抗體的純化 在-80℃下取出抗Cap單抗腹水，并通過硫酸銨-辛酸沉淀法進行純化[7]：調節腹水pH至4.8；加入1/25體積辛酸并攪拌；靜置離心，取上清調節pH至7.2，50%硫酸銨沉淀，將沉淀溶解在PBS中，再用45%硫酸銨二次沉淀，PBS溶解沉淀，透析過夜；離心取上清，測定蛋白質含量，并稀釋至工作濃度。

1.3 兔多克隆抗體制備與測定 將Cap蛋白與完全弗氏佐劑混合（比例為1∶1），皮下注射新西蘭黃兔（首次免疫），15 d后進行第二次免疫，該程序與第一次免疫相同。二免15 d后，改用不完全弗氏佐劑和Cap蛋白1∶1重新混合進行再次免疫，免疫5 d后收集兔血清，收集空白組兔血液作為陰性對照，間接ELISA測定陽性血清效價。

1.4 單抗最佳包被濃度的確定 將純化的單抗用包 被 液 稀 釋 至 1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 包 被 于ELISA 板中，100 μL/孔，重復 3次，并在 4℃冰箱保存過夜；第2 d倒出板中的液體，用含有0.05%吐溫的PBS沖洗，拍干孔內液體，再次加入100 μL封閉液，在濕盒中 37 ℃下封閉 l h；洗滌；加入 100 μL（1∶20）待檢樣品，37℃濕盒孵育1 h；洗滌；各孔加入100 μL （1∶4 000）PCV3 陽性血清，37 ℃濕盒孵育1 h；洗滌；將稀釋后的羊抗兔 HRP-IgG（1∶5 000）加入 ELISA 板中，100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育 l h；洗滌； 加底物 TMB 顯色液 （100 μL/孔），37℃顯色20 min；向各孔加入100 μL終止液，15 min內在酶標儀中測OD450值；根據各孔OD值計算P/N值，判讀結果。

1.5 包被條件的選擇 鎖定試劑最佳作用濃度，其他條件均不改變的前提下，同一時間段進行兩組包被條件的選擇（4℃過夜，37℃、2 h）。

1.6 一抗最佳作用濃度的確定 保持單抗包被濃度 不 變 ，PCV3 陽 性 血 清 按 照 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000 的比例稀釋，其他操作同 1.4。

1.7 酶標二抗最佳作用濃度的確定 保持單抗包被濃度、PCV3陽性血清作用濃度不變，將羊抗兔HRP-IgG 按 1∶5 000、1∶10 000 兩個梯度進行操作，其他操作同1.4，讀取OD450nm值選擇酶標二抗最佳作用濃度。

1.8 臨界值判定 使用建立的夾心ELISA方法，檢測本實驗室制備的28份豬PCV3陰性樣品的OD450值。計算平均值(X)和標準差(SD)，陽性臨界OD450值≥X+3SD；陰性臨界OD450值≤X+2SD，介于之間者判定為可疑。

1.9 特異性試驗 使用建立的夾心ELISA方法檢測豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒 （PRV）、PCV2和PCV3陽性樣本，測試建立的夾心ELISA方法的特異性。

1.10 重復性試驗 用制備的同批次和不同批次的包被板，不同時間檢測3種不同梯度的陽性樣品，每組樣品進行3組重復，計算標準差和變異系數，并分析組內和組間重復性。

1.11 臨床應用 建立的夾心ELISA診斷方法和現有的PCR診斷方法同時用于檢測收集的19份不同豬的不同組織，比較兩種方法的測試結果，并評估該方法的臨床適用性。

2 結 果

2.1 單抗純化 辛酸-硫酸銨蛋白沉淀法純化之后，測定蛋白含量為1.2 mg/mL，用PBS稀釋至1 mg/mL，分裝保存，進行下一步試驗。

2.2 兔多抗血清的制備與鑒定 最后一次注射3 d后收集血清，通過間接ELISA測定效價達到1∶16 000，具體數據見表1。

2.3 夾心ELISA最佳工作條件的確定 根據預試驗，固定重組蛋白液的稀釋比例為 1∶20，即 0.9 μg/mL。控制包被抗體作為單一變量，將P/N最大值的包被量（10 μg/mL）定為最佳濃度，結果見表 2。

表2 單抗包被濃度篩選結果

以最佳包被濃度包被單抗，控制一抗作為單一變量，結果見表3，確定一抗最佳稀釋濃度為1∶4 000，此時陽性對照OD450值最接近1。

表1 兔豬陽性血清抗體效價檢測

表3 一抗最佳作用濃度結果

在先前確定濃度的基礎上，將酶標二抗羊抗兔HRP-IgG 分 1∶5 000、1∶10 000 進行對比， 推薦使用量1∶5 000更為合適，結果見表4。

表4 羊抗兔IgG濃度篩選結果

按照最佳試劑作用濃度，改變包被條件。表5試驗結果顯示，包被條件4℃過夜略優于37℃、2 h。

表5 包被條件篩選結果

2.4 臨界值判定 通過對28份陰性樣品的測試，測得450 nm下的OD值，計算平均值與標準差，結果顯示平均值為0.2048，標準差為0.0687。以X+3SD為陽性臨界，X+2SD為陰性臨界。即OD值超過0.4110為陽性，低于0.3423為陰性，介于0.3423～0.4110為可疑。具體數據見表6。

2.5 特異性試驗 對實驗室保存的豬口蹄疫病毒（FMDV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、PCV2和PCV3蛋白樣品進行檢測，結果見表7，未發現該方法存在交叉反應，無關病毒檢測陰性，該方法有良好的特異性。

2.6 重復性試驗 用制備的同批次和不同批次的包被板，不同時間檢測3種不同梯度的陽性樣品，每組樣品進行3組重復，并計算其標準差和變異系數，分析其組內和組間重復性。結果顯示該方法可重復性良好，批內和批間的變異系數均處于5%內。具體結果見表8-表9。

2.7 臨床應用 用建立的夾心ELISA診斷方法和已有的PCR診斷方法分別對采集的19份不同豬不同組織進行檢測，結果見表9。建立的夾心ELISA方法檢測出11份陽性；而PCR檢測結果陽性13份，陰性6份，該診斷方法與PCR方法符合率達到84.6%，總體效果仍然相對比較理想。結果也表明淋巴結樣品OD值高于同源其他組織樣品，推測所含病毒量較其他組織會有差異。

表6 28份陰性樣品測試結果

表7 夾心ELISA特異性檢測結果

表8 批內重復性試驗結果

表9 批間重復性試驗結果

表10 兩種方法臨床檢測結果

3 討 論

PCV3對生豬養殖行業的危害日趨加重，對其防治也逐漸為各國所重視，目前對于PCV3的檢測手段有僅限于分子生物學和血清學檢測，未發現有成功分離病原的報告[4]。也只有ELISA檢測對試驗條件要求較低，庫旭剛等[8]針對PCV3的ORF2基因表達進行間接ELISA方法的建立，宋長緒[9]申請間接ELISA檢測試劑盒專利，都是圍繞間接ELISA方法來實現的。

對于圓環2型病毒，有進行夾心ELISA診斷方法建立的先例[10]，故PCV3的夾心ELISA也具有實踐可行性。本試驗是在實驗室制備的抗Cap蛋白單抗隆抗體的基礎上進行的，試驗過程中也發現有很多可以提高檢測結果可靠度的操作。在洗滌操作中，洗滌五次的同時加大洗滌液的用量，可以很好地將離散度控制下來；同時在對不同組織的檢測中也發現，不同組織檢測的OD值存在差異，推測不同組織的含毒量會有所不同，需要進一步驗證。

總之，基于最佳反應條件下夾心ELISA檢測方法的特異性、靈敏性和可重復性，在臨床初步測試中表現良好，與PCR符合率達到84.6%。對于流行病學調查、豬場的一般檢測具有一定的意義。