番鴨感染MDRV對十二指腸上皮內淋巴細胞數量的影響

丁美珍 福建省光澤縣動物衛生監督所 福建光澤 354100

黏膜既存在局部免疫又存在共同免疫系統，黏膜免疫系統是機體相對獨立的免疫系統[1]，病原微生物入侵畜禽機體時，腸道黏膜免疫系統能夠起到阻礙和抵御作用[2]，在腸道免疫防御中起重要作用的包括上皮內淋巴細胞[3]。因此，需要通過試驗為番鴨感染呼腸孤病毒后十二指腸上皮內淋巴細胞數量的變化提供論證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 1日齡番鴨若干；試驗毒株及主要材料：番鴨呼腸孤病毒、番鴨種蛋若干。

1.1.2 試驗主要試劑和器材 試驗室自配的4%多聚甲醛固定液、蘇木精染液、1%伊紅染液、1%鹽酸酒精；處理過的蓋玻片及載玻片；恒溫水浴鍋；恒溫干燥箱；高壓滅菌鍋；移液管；超凈工作臺；冰箱；組織研磨器；冷凍離心機；切片機；廣口瓶；滅菌紗布、剪刀、鑷子等。

1.2 試驗方法

1.2.1 擴增番鴨呼腸孤病毒 孵化1周的40枚番鴨種蛋，經卵黃囊接種番鴨呼腸孤病毒后第4～6 d共死亡26枚，收取死亡鴨胚的胚體及尿囊液，用組織研磨器、冷凍離心機擴增番鴨呼腸孤病毒，并放入-20℃冰箱中儲存待用。

1.2.2 試驗動物分組 將100羽1日齡無MDRV感染的番鴨進行隨機分組：同居感染組（ICG）40羽、空白對照組（NCG）40 羽、人工感染組（AIG）20 羽。人工感染組的每羽番鴨腿部肌注200 uL番鴨呼腸孤病毒液，攻毒后第3 d將人工感染MDRV并做好標記的番鴨放入ICG組進行感染，標記同居感染時間，試驗番鴨都正常進行自由采食和飲水。

1.2.3 取樣及組織切片制作

1.2.3.1 取樣及固定 同居感染后第2 d、3 d、4 d、6 d、9 d、15 d每組隨機抽取番鴨各5羽，用滅菌消毒的試驗剪剪取十二指腸腸段約1 cm，無菌洗凈后放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.3.2 組織切片制備 用常規法將采集的組織樣本制備成石蠟組織切片，用中性樹膠及蓋玻片封片，組織切片采用HE染色。

1.2.3.3 腸絨毛上皮內淋巴細胞計數 光學顯微鏡下觀察腸絨毛上皮內淋巴細胞分布與數量。具體方法為：每個試驗組選取5張著色良好的切片，每張切片均隨機抽取5根最長且排列整齊的腸絨毛在40×10倍顯微鏡下進行觀察、拍照并計數，對每一百個上皮柱狀細胞間的上皮內淋巴細胞進行計數。

1.3 數據統計和處理 用SPSS.17.0軟件對試驗數據進行分析，結果用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

正常番鴨十二指腸絨毛結構較為完整，上皮內淋巴細胞數量較多（見圖1）；感染呼腸孤病毒的番鴨十二指腸絨毛結構出現破損，計數單位內的上皮內淋巴細胞均相對減少（見圖2）。由表1、圖3可以看出，NCG組番鴨在試驗生長過程中，其十二指腸上皮內淋巴細胞的數量較多且浮動較小；感染MDRV的ICG組番鴨，其十二指腸上皮內淋巴細胞的數量在第4 d先出現明顯下降，在無外在干預的條件下，之后略有上升但數量依舊維持在較低水平，與NCG組相比分別降低13.78%、23.73%、33.07%、32.02%、33.68%、30.76%，差異均極顯著（P＜0.01）。

圖1 正常番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞

圖2 MDRV感染番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞

3 討 論

在試驗過程中，發現NCG組的番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞的數量波動不明顯，ICG組番鴨在病毒感染后的第2～4 d，其十二指腸上皮內淋巴細胞下降較快，在感染呼腸孤病毒第4 d，十二指腸上皮內淋巴細胞的數量最少。該試驗現象表明，呼腸孤病毒感染會破壞腸黏膜結構，致使番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞數量在防御過程中大量減少。感染呼腸孤病毒的番鴨在第6 d、9 d、15 d，其十二指腸上皮內淋巴細胞數量出現明顯減少后便維持在一個相對較低的水平，試驗數據證明番鴨在感染呼腸孤病毒后十二指腸上皮內淋巴細胞數量出現減少且不易恢復正常。

表1 試驗番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞數量情況

圖3 番鴨十二指腸上皮內淋巴細胞數量的變化