霍山石斛糖蛋白的提取方法優選及抗氧化活性分析

鄧 輝， 崔紹進， 朱富成， 韓邦興,3,4， 陳乃東,3,4， 陳乃富,3,4

(1. 皖西學院 生物與制藥工程學院， 六安 237012； 2. 中科院云計算中心公共安全研究院， 東莞 523808； 3. 安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室， 六安 237012；4. 安徽省石斛產業化開發協同創新中心， 六安 237012)

1 材料和方法

1.1 儀器設備

電子天平(GL-20G-II,上海安亭科學儀器廠)；高速冷凍離心機(ST-16R，Thermo Fisher Scientific)；電泳儀(DYCZ-24A，北京六一儀器廠)；紫外可見分光光度計(UV-2000，尤尼柯上海儀器有限公司)；臺式凍干機(BenchTop Pro，德祥科技有限公司)；臺式高速冷凍離心機(Allegra-15R，美國BECKMAN公司)等。

1.2 材料和試劑

霍山石斛，采自皖西學院藥用植物園。標準分子量蛋白(低范圍，上海生工)，碳酸氫鈉，硫酸銨，硫酸，苯酚，葡萄糖，無水乙醇，正丁醇，氯仿，丙酮，考馬斯亮藍G250R250，堿性品紅，偏重亞硫酸鈉，高碘酸，甲醇，冰乙酸等均為國產分析純。

1.3 實驗方法與步驟

1.3.1 鹽溶液浸提糖蛋白步驟

精確稱取10 g新鮮霍山石斛莖，勻漿機粉碎，用200 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液4℃浸提，過夜，過濾取上清液，進行硫酸銨分級沉淀。稱取適量硫酸銨邊加邊攪拌到上清液中(飽和度40%)，4℃冰箱過夜，離心(4℃，4000 r/min，40 min)；待離心結束，收集沉淀，向上清液中邊攪拌加入適量硫酸銨(飽和度70%)進行二級沉淀，4℃冰箱過夜，離心(4℃，4000 r/min，40 min)；收集二級沉淀，向上清液中邊攪拌加入適量硫酸銨(飽和度100%)進行三級沉淀，4℃冰箱過夜，離心(4℃，4000 r/min，40 min)；收集三級沉淀→沉淀透析。取3個透析袋沸水煮10 min，檢漏，分別將一級、二級、三級所得的粗糖蛋白提取液倒入3個透析袋中，懸掛在去離子水的燒杯中，進行攪拌透析，換水3次，透析液用聚乙二醇10 000濃縮，收集一、二、三級濃縮液到血清瓶中，貼好標簽，即得鹽溶液浸提糖蛋白提取濃縮液。冷凍干燥制備凍干粉[21-23]。

1.3.2 水提醇沉浸提糖蛋白步驟

精確稱取3份10 g新鮮霍山石斛莖，勻漿機粉碎，放入燒杯中，向每個燒杯中加200 mL蒸餾水，4℃水浴攪拌浸提3 h，提取結束后分別收集水提糖蛋白粗樣液，向3份浸提樣液中分別加入50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇進行醇沉，醇沉4℃冰箱過夜。離心(4℃，4000 r/min，40 min)分別收集加入不同濃度乙醇所得到的沉淀，用無水乙醇洗滌后，冷凍干燥備用。將干品用去離子水復溶，即為水提醇沉糖蛋白提取液[24-26]。

1.3.3 12%SDS-PAGE電泳和染色

床邊責任制護理工作的排班也應該分為3個班次，加強護理人員之間工作的銜接，提升護理的質量。在白天，早上和下午的排班中，科室需要合理安排參與床位護理的護理人員數量，通常情況下，安排2-3名床位護理人員最為合適。另外，還需要為每組安排給藥護理，提高護理的質量。根據科室的具體情況安排1位主班護理人員，在夜間床位護理中，分配2名護理人員進行值夜護理。

12%SDS-PAGE實驗參考蛋白質電泳實驗技術[27]，同一塊膠，以中間為界點加相同樣品，電泳完畢，從中間切開，一半用考馬斯亮藍染色，經考馬斯亮藍G250染色、脫色，蛋白電泳條帶呈現藍色，用來檢測蛋白[28-29]；一半用PAS(Periodic acid-schiff stain)染色，過碘酸把糖類相鄰兩個碳上的羥基氧化成醛基，再用Schiff試劑和醛基反應使呈現紫紅色，用來檢測糖類[30-31]。

1.3.4 糖蛋白粗品抗氧化活性

2)羥基自由基(·OH)清除率的測定采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[33]。

·OH 清除率=(A樣品-A氧化)/(A未氧化-A氧化)

2 結果與分析

2.1 鹽提糖蛋白電泳結果

低鹽溶液浸提物電泳結果見圖1，浸提物電泳后分別平行進行了考馬斯亮藍染色和PAS染色。

2.2 水提醇沉提糖蛋白電泳結果

水提醇沉糖蛋白電泳結果見圖2，水提醇沉產物電泳后分別平行進行了考馬斯亮藍染色和PAS染色。

2.3 實驗分析

糖蛋白條帶為既能被考馬斯亮藍染色又能被PAS染色的條帶。由表1來看，鹽溶液浸提法獲得的一級樣液中的蛋白分子分布在31～97.4 ku之間，共有8條帶，多糖分子分布在31～66.2 ku之間，共有5條帶，能同時被染色的糖蛋白條帶有5條。二級樣液中的蛋白分子分布31～66.2 ku之間和14.4 ku處，共5條帶，多糖分子在31～66.2 ku之間和14.4 ku處，共6條帶，能同時被染色的糖蛋白條帶也有5條。三級樣液中的蛋白分子分布在31～66.2 ku之間共3條帶，多糖分子31～66.2 ku之間，共3條帶，能同時被染色的糖蛋白條帶僅有3條。

M為蛋白Marker電泳條帶；1，2，3泳道分別為低鹽溶液浸的一級、二級和三級糖蛋白溶液的考馬斯亮藍染色條帶；1′，2′，3′泳道分別為低鹽溶液浸的一級、二級和三級糖蛋白溶液的PAS染色條帶

圖1低鹽溶液浸提產物SDS-PAGE電泳及染色

Figure 1 Results of SDS-PAGE electrophoresis and staining of low salt solution extraction products

M為蛋白Marker電泳條帶；1，2，3泳道分別為50%、70%和90%乙醇沉淀提取糖蛋白溶液的考馬斯亮藍染色條帶；1′，2′，3′泳道分別為50%、70%和90%乙醇沉淀提取糖蛋白溶液的PAS染色條帶

圖2 水提醇沉提取產物SDS-PAGE電泳及染色

由表2水提醇沉浸提糖蛋電泳條帶結果可以看出，50%乙醇醇沉樣液，70%醇沉樣液，90%醇沉樣液中的蛋白分子都分布在43～66.2 ku附近，各有兩條帶，多糖分子也分布在43～66.2 ku附近，同樣各有兩條帶，與鹽溶液浸提產物染色圖譜中相應位置的條帶相對應。

表2 水提醇沉產物染色結果分析

3 霍山石斛糖蛋白抗氧化活性

3.1 清除超氧陰離子自由基能力的分析

檢測由鹽溶液浸提法提取獲得的一、二、三級糖蛋白濃縮液(P1、P2、P3)，對超氧陰離子自由基的清除率。結果(如圖3)顯示，在給定濃度范圍內，其清除率隨著糖蛋白濃度的增加而增加，相同濃度下，其清除率強弱順序為：P2>P1>P3，這與各組分糖蛋白溶液的含量、譜帶相對應，即濃度越高、譜帶越多，清除率越高。當P2組分濃度為0.9 mg/mL時，其超氧陰離子自由基的清除率達到(88.71±2.68)%。

圖3 不同糖蛋白組分清除超氧陰離子自由基的能力

3.2 清除羥基自由基能力的分析

檢測由鹽溶液浸提法提取獲得的一、二、三級糖蛋白濃縮液(P1、P2、P3)，對羥基自由基的清除率。結果(如圖4)顯示，在給定濃度范圍內，其清除率隨著糖蛋白濃度的增加而增加，但當濃度大于0.5 mg/mL時，清除率增幅變小。相同濃度下，其清除率強弱順序仍為：P2>P1>P3，這同樣與各組分糖蛋白溶液的含量、譜帶相對應，即濃度越高、譜帶越多，清除率越高。

圖4 不同糖蛋白組分清除羥基自由基能力

4 霍山石斛糖蛋白提取條件優化

4.1 浸提溶液濃度對糖蛋白得率的影響

在浸提溫度為4℃，料液比為1∶20，浸提時間為12 h 的條件下，考察浸提溶液濃度中NaCl分別為0.1、0.3、0.5、0.7及0.9 mol/L 時，霍山石斛粗糖蛋白的提取率，實驗設置3個重復，實驗結果見圖5。

圖5 不同浸提溶液濃度下糖蛋白的提取率

當浸提溶液濃度為0.3 mol/L 時，粗糖蛋白的提取率最高，低于或高于次濃度，糖蛋白的提取率均下降，糖蛋白兼具糖和蛋白的性質，隨鹽濃度增大，糖溶解率越來越小，蛋白溶解率現先大后小，實驗確定糖蛋白浸提溶液濃度為0.3 mol/L。

4.2 液料比對糖蛋白得率的影響

在浸提溫度為4℃，在浸提溶液濃度為0.3 mol/L，浸提時間為12 h 條件下，考察浸提液料比分別為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1和20∶1時對粗糖蛋白提取率的影響，實驗設置3個重復，結果見圖6。

圖6 料液比對糖蛋白得率的影響

當液料比小于12∶1時，粗糖蛋白提取率隨溶劑量增加而增加較快，當料液比大于16∶1 時，粗糖蛋白提取率隨溶劑量增加而增加緩慢，考慮到糖蛋白后續的分離純化成本，實驗選擇為16∶1作為提取的液料比例。

4.3 提取時間對糖蛋白得率的影響

在浸提溫度為4℃，在浸提溶液濃度為0.3 mol/L，浸提液料比為16∶1條件下，考察浸提時間分別為6、9、12、15和18 h 時對粗糖蛋白提取率的影響，實驗設置3個重復，結果見圖7。

圖7 提取時間對糖蛋白得率的影響

在浸提時間小于9 h 時，粗糖蛋白提取率升高迅速，以后增加緩慢，綜合考慮提取效率和提取率兩個因素，選擇適宜的浸提時間為12 h。

4.4 低鹽浸提法正交試驗結果

正交試驗結果見表3。極差分析表明，影響粗糖蛋白得率影響糖蛋白得率各因素主次順序為：鹽溶液濃度>料液比>提取時間。正交試驗結果表明，糖蛋白的最優提取條件為A2B3C3， 即NaCl 溶液濃度為0.3 mol/L、液料比為16∶1、提取時間為12 h。此條件下低鹽溶液浸提糖蛋白的最終獲得的提取率為粗糖蛋白得率12.56%±0.35%。

表3 正交試驗結果分析

5 結論

實驗分別考察兩種辦法提取蛋白的鹽溶液浸法和提取多糖的水提醇沉法，在4℃下提取霍山石斛糖蛋白的效果，提取液經12%的SDS-PAGE電泳后，分別進行蛋白染色和糖染色，結果發現鹽溶液浸法獲得的糖蛋白相比水提醇沉法獲得的糖蛋白，有著更高的濃度和譜帶數。針對鹽溶液浸提法進一步開展單因素和正交優化實驗，得到最佳的浸提條件為浸提濃度為0.3 mol/L，液料比例為16∶1，浸提時間為12 h。

體外抗氧化實驗表明，鹽溶液浸提液中分級沉淀的3個組分，在給定的質量濃度范圍內，都具有清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，但清除能力不同，飽和度為40%～70%的硫酸銨溶液沉淀獲得的糖蛋白組分(P2樣液)抗氧化活性最強，雖然P1樣液所含糖蛋白條帶數與之相近，但P2樣液具有一條濃度明顯偏高的低分子量蛋白(分子量小于14.4 ku)，此蛋白可能有更高的抗氧化作用，其具體組成和生物活性有待進一步研究和證實。