超臨界二氧化碳萃取大別山五針松針葉揮發油及其成分分析

項小燕， 吳甘霖， 段仁燕， 王志高， 劉家雷

(1. 安慶師范大學 生命科學學院， 安慶 246133； 2. 皖西南生物多樣性研究與生態保護安徽省重點實驗室， 安慶 246133; 3. 岳西縣林業總場， 岳西 246600)

大別山五針松(PinusdabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law), 隸屬松科松屬，僅分布于我國東部大別山區900～1300 m的狹小范圍內，野生種群僅200余株[1]。近年來，種群的保護已引起了國家相關部門及一些科研人員的關注。目前已有研究分別從花粉飛散[2]、花粉活力[3]、種間聯結和競爭[4-5]及遺傳多樣性[6]等方面對大別山五針松的瀕危機制進行了報道。除自身生物學特性外，該物種還受到一些昆蟲的取食和危害，從而加劇了其瀕危的速度。

在正常的生理狀態下，植物會產生相應的揮發物，在昆蟲尋找寄主的識別過程中起著關鍵的通訊引導作用，從而調控著昆蟲的寄主定向、產卵、逃避、取食等多種行為[7～8]。大別山五針松蟲害的發生應該有其特殊的原因，其揮發性物質的特異組分可能是昆蟲對寄主定向選擇的重要信息物。然而，大別山五針松揮發油的化學成分研究尚未見報道。針葉是大別山五針松植株的重要組成部分，因而本研究用超臨界二氧化碳萃取法提取大別山五針松健康株針葉的揮發油，并進行GC-MS分析，以期為揭示昆蟲與大別山五針松的寄主機制提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料的采集

2016年4月，從安徽省岳西縣大王溝大別山五針松自然種群采集健康株針葉。經安徽師范大學生命科學學院張小平教授鑒定為大別山五針松(P.dabeshanensisW. C. Cheng & Y.W. Law)的針葉，憑證標本保存于安慶師范大學標本館。

1.2 超臨界二氧化碳萃取

所采集的針葉60℃烘干至恒重。將烘干的針葉粉碎過10目篩。稱取250 g粉末置萃取釜中按以下條件萃取。萃取釜壓力24 Mpa(溫度45℃)，分離釜I壓力9 Mpa (溫度40℃)，分離釜Ⅱ壓力5 Mpa(溫度35℃)，CO2流量12 L/h，萃取2 h。得精油0.59 g，得率為0.24%，所得精油置4℃避光保存待用。

1.3 GC-MS分析條件

所得精油在HP6890/5973 GC-MS聯用儀(美國，惠普公司)上進行分析，進樣量1 μL。色譜柱為石英毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，初始溫度60℃(保留5 min)，程序升溫，以10℃/min升溫至 250℃，保持18 min。載氣為高純He(99.99%)，流速1 mL/min。進樣口溫度為250℃(分流比50∶1)，檢測溫度保持在280℃。質譜條件：離子源為EI源(70 eV)，離子源溫度230℃，質量掃描范圍為30～550 amu。將總離子流圖中各峰經質譜掃描后得到質譜圖，通過HPMSD化學工作站，結合Wiley 275和NIST 98標準質譜圖庫進行檢索，采用峰面積歸一化法計算各組分在揮發油中的相對百分含量。

2 結果與分析

按GC-MS分析條件，取供試品溶液1.0 μL進樣，得超臨界二氧化碳萃取的大別山五針松針葉揮發油的總離子流圖，見圖1。經GC-MS分析后，共鑒定出33種化合物，用峰面積歸一化法算出其百分含量，所鑒定的化合物占總離子流圖峰面積的81.70%。所鑒定的物質主要由萜類(36.65%)、醇類(22.96%)、烷烴類(11.33%)和酯類(10.76%)等化合物組成。其中，(-)-斯巴醇(11.55%)，d-杜松烯(10.72%)、α-杜松醇(8.65%)、石竹烯(7.26%)和蒎烷(6.43%)等化學成分的相對含量較高，結果見表1。

圖1 SFE法提取的大別山五針松針葉揮發油的總離子流圖

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相對含量/%Relative amount烷烴類 Alkanes蒎烷2,6,6-Trimethylbicyclo [3.1.1]heptaneC10H181386.43Naphthalene, 1,2,4a,5,6,8a-Hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-C15H242042.421-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫化萘1-Isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthaleneC15H242041.28(1R,4aR,8aS)-,1,2,4a,5,6,8a-六氫化-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)萘Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1R,4aR,8aS)-C15H242040.88十二甲基-環六硅氧烷Cyclohexasiloxane, dodecamethyl-C12H36O6Si64440.32萜烯類 Terpenesd-杜松烯d-CadineneC15H2420410.72石竹烯CaryophylleneC15H242047.262,8-二甲基-1,8-壬二烯1,8-Nonadiene, 2,8-dimethyl- C11H201523.84(+)-表倍半水芹烯 (+)-Epi-bicyclosesquiphellandreneC15H242043.22西松烯1,3,6,10-Cyclotetradecatetraene,3,7,11-trimethyl-14-(1-methylethyl)-C20H322722.45α-衣蘭油烯α-MuuroleneC15H242040.88α-石竹烯α-CaryophylleneC15H242041.67可巴烯Copaene C15H242041.58香樹烯AlloaromadendreneC15H242040.95大根香葉烯D Germacrene DC15H242040.94環氧白菖油烯Calarene epoxideC15H24O2200.72環氧異香橙烯Isoaromadendrene epoxideC15H24O2200.69

續表1(Continued Table 1)

化合物Compounds分子式Molecular formula分子量/kuMolecular weight相對含量/%Relative amount(6E,10E)-7,11,15-三甲基-3-亞甲基-1,6,10,14-十六碳四烯(6E,10E)-7,11,15-Trim-ethyl-3-methylene-1,6,10,14-hexadecatetraeneC20H322720.63去氫白菖烯CalameneneC15H222020.34α-蓽澄茄烯α-CubebeneC15H242040.22B-欖香烯B-ElemenC15H242040.32B-新丁香三環烯B-Neoclovene C15H242040.22醇類 Alcohols(-)-斯巴醇 (-)-SpathulenolC15H24O22011.55α-杜松醇α-CadinolC15H26O2228.653,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇3,7,11,15-Tetramethyl-2- hexadecen-1-olC20H40O2962.76酯類 Esters丁基香茅酯Citronellyl butyrateC14H26O22263.474-羥基-4-甲基-2-戊酮2-Pentanone, 4-hydroxy-4-methyl-C6H12O21162.29油酸乙酯Ethyl oleate C20H38O23101.58棕櫚酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester C18H36O22841.20亞油酸乙酯Ethyl linoleate C20H36O23081.03菊酸乙酯Ethyl chrysanthemateC12H20O21960.48鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalateC16H22O42780.38醋酸冰片酯Bornyl acetateC12H20O21960.33

3 討論

萜類化合物是植物的特異氣味組分, 在許多害蟲對寄主的選擇和識別過程中起著關鍵的作用[9]，可作為信號介導對植食性昆蟲產生防御反應, 并在植物-害蟲-天敵的三級營養關系中發揮作用[8]。樸相勇等[9]和滕坤等[10]用水蒸氣蒸餾法分別從紅松和赤松中提取到了α-蒎烯、β-水芹烯和莰烯等成分。田玉紅等[11]用水蒸氣蒸餾法從拉雅松和細葉云南松松針中提取到了較高含量的α-蒎烯和β-石竹烯。研究表明, 影響和調節松科害蟲取食和產卵行為最為重要的信號物質包括萜類化合物中的蒎烯、莰烯和水芹烯等[9]。本文首次報道了大別山五針松針葉揮發油的主要成分。盡管所提取的揮發油中也檢測到較高含量的萜類化合物，但未發現上述幾類重要的信號物質。因而，大別山五針松揮發物對害蟲具體產生了怎樣的影響還需要從昆蟲的電生理及嗅覺反應等方面進一步測定。

大別山五針松針葉揮發油的成分和含量與上述物種有所不同，可能是不同的植物揮發油存在較大差異[12-13]，也可能是提取方法不同而導致。以往研究多以水蒸氣蒸餾法提取針葉揮發油，而本文采用了超低溫、萃取效率高的超臨界二氧化碳萃取法提取大別山五針松針葉的揮發油。

盡管目前在大別山五針松針葉的揮發油中未發現重要的植物-害蟲-天敵信號化合物，本研究也檢測到了一些有價值的成分。如d-杜松烯和蒎烷可用于制作香料，石竹烯和斯巴醇具平喘、祛痰功效。因而本研究為后期人工栽培進一步開發利用針葉資源提供了科學依據。

致謝：感謝安慶師范大學生命科學學院吳彥教授在超臨界流體萃取方法中給予的技術指導。