不同氮源對刺芹側耳谷氨酰胺合成酶的酶活力及基因表達影響

汪 瀅， 尚俊軍， 茅文俊， 王 瑩， 鮑大鵬， 李 燕

(上海市農業科學院 食用菌研究所， 上海 201403)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側耳。杏鮑菇栽培作為一項現代高新農業產業，對調整農業產業機構，推動農業可持續發展，促進農業增效、農民增收具有重要意義[1]。目前，刺芹側耳在我國已實現工廠化栽培，是一種深受歡迎的珍稀食用菌。工廠化栽培刺芹側耳采用人工培植的培養料，氮源是其中主要的營養成分。氮的吸收和同化對刺芹側耳菌絲生長和子實體的發育有著直接的影響[2]，因此對刺芹側耳氮素的利用研究有著極其重要的意義。

程向陽等[7]利用RACE技術從刺芹側耳基因組中克隆得到刺芹側耳谷氨酰胺合成酶編碼基因(PE-GS)的cDNA全長，并利用RT-PCR對其表達進行了初步的研究，發現PE-GS基因在子實體階段的表達量相比菌絲體階段上調。本研究利用硫酸銨、硝酸鈉和尿素等不同類型的氮源在不同濃度下培養刺芹側耳菌絲，測定了刺芹側耳對不同氮源的利用情況，比較并分析不同氮源對PE-GS基因的表達特性和GS酶活力的影響。通過對PE-GS的表達特性研究有助于揭示其功能特點，為食用真菌氮素代謝的分子水平研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養

刺芹側耳國森一號菌株由上海市農業科學院食用菌研究所保藏并提供。

1.2 培養條件

PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

PDB培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL。

基本無氮培養基：KH2SO41.5 g，MgSO4·7H20 0.75 g，葡萄糖20 g，維生素B120 mg，蒸餾水1000 mL。

不同類型的氮源培養：在基本無氮培養基中分別添加當量濃度為30 mmol/L的(NH4)2SO4、NaNO3、尿素(Sangon 中國上海)，作為3種不同類型的氮源培養刺芹側耳菌絲。

不同濃度的氮源培養：在基本培養基中分別添加(NH4)2SO4、NaNO3、尿素作為氮源，氮素當量濃度從低到高依次為2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 mmol/L。

菌種于PDA培養基上保存。刺芹側耳菌種在PDB中25℃培養獲取新鮮菌絲體。取新鮮的刺芹側耳菌絲，用無菌的無紡布過濾收集全部菌絲，菌絲用無菌蒸餾水反復沖洗數次后，用均質儀(Waring 美國)打碎刺芹側耳菌絲轉接入100 mL基本培養基中25℃下150 r/min搖床培養7 d后，收集菌絲。

1.3 菌絲收集

用無菌的無紡布過濾收集菌絲，菌絲用無菌蒸餾水反復沖洗數次后，用無菌吸水紙吸干水分，迅速移放液氮中冷凍15 min，移至-70℃冰箱保存備用。

1.4 生物量測定

將基本培養下培養得到的刺芹側耳菌絲置于液氮中冷凍15 min至凍結完全后，在真空冷凍干燥機 (Labogene 美國)中充分干燥15 h至水分分離完全，采用分析天平 (Mettler Toledo 美國)統計不同樣品的生物量。

1.5 GS酶活測定

1.6 總RNA提取及cDNA合成

刺芹側耳總RNA提取采用Trizol法[9]。按照Trizol試劑(賽百勝生物技術有限公司，中國北京)的說明書提取刺芹側耳樣品的總RNA。參照PrimeScriptTMRT rtagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，中國大連)的說明書，去除基因組DNA，并反轉錄成cDNA，-20℃保存備用。

1.7 Real Time RT-PCR

1.7.1 引物設計。選擇刺芹側耳β-actin基因(GenBank登錄號：HQ699070)作為內參基因[10]，根據刺芹側耳PE-GS基因(GenBank登錄號：KJ466899)的cDNA基因片段和β-actin基因cDNA基因片段設計合成RT-PCR引物(表1)。

表1 Real Time RT-PCR所使用的引物

1.7.2 重組標準品質粒的制備。應用表1中的引物，以刺芹側耳cDNA作為模板，進行PCR擴增。50 μL PCR反應體系包含(20 μL)：50 ng DNA，10×PCR反應緩沖液 2 μL，2 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各0.25 μmol/L，2U TaKaRa ExTaq(TaKaRa，中國大連)。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環；最后于72℃補平5 min。PCR反應在ABI VeritiTM96 PCR儀上進行。PCR 產物的克隆使用pGEM-T試劑盒(Promega，美國)，按照說明書進行操作。測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。按照質粒快速提取試劑盒(捷瑞生物工程有限公司，中國上海)的說明書純化質粒。

1.7.3 刺芹側耳PE-GS基因表達的Real Time RT-PCR分析。刺芹側耳PE-GS基因表達的定量分析采用Real Time RT-PCR法。測定純化質粒的OD值，將PE-GS和β-actin重組標準品質粒10倍梯度稀釋后，應用SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(TaKaRa，中國大連)，分別以系列稀釋的質粒為模板在Applied Biosystems StepOneTM實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)上，以表1所列引物進行定量PCR擴增反應，從而可以同時得到目的基因和內標基因的標準曲線和回歸方程。合成反應總體積為20 μL，包括Premix ExTaqTM10 μL，10 μmol/L正反向引物各0.4 μL，ROX reference Dye(50×) 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，模板DNA(50 ng/μL)2 μL。反應條件：95℃預變性20 s，然后95℃變性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，共40個循環。

2 結果與分析

2.1 生物量統計

通過對不同處理菌絲干重的測定發現，分別以硫酸銨、硝酸鈉和尿素為單一氮源時，刺芹側耳菌絲都能夠生長，但菌絲生長量存在明顯的差異(圖1)。刺芹側耳菌絲對3種氮源的利用程度為：尿素>硫酸銨>硝酸鈉。以尿素和硫酸銨為氮源時，氮源濃度增加時，菌絲生物量明顯增長，而以硝酸鈉為單一氮源培養時，菌絲生物量較低，且硝酸鈉濃度的增加，菌絲生物量增加不明顯。這和馬璐[11]、王振河[12]等的研究結果一致，即刺芹側耳對有機氮的利用高于無機氮，無機氮中刺芹側耳對銨態氮的利用高于硝態氮。

2.2 GS酶活力測定

3種氮源分別在不同濃度下培養刺芹側耳菌絲，其菌絲體GS酶活表現差別較大(圖2)。相同氮素濃度下培養下，GS酶活性從大到小順序為：硝酸鈉、尿素、硫酸銨。且以硝酸鈉為氮源，相比硫酸銨和尿素，其酶活性大小的差距逐漸增大。以硫酸銨和尿素為氮源時，GS的酶活力隨氮源濃度的升高而降低。

圖1 3種不同類型的氮素在不同濃度下對刺芹側耳菌絲體的生物量的影響

圖2 3種不同類型的氮素在不同濃度下對GS酶活的影響

A：3種不同的氮素(30 mmol/L)對PE-GS基因表達的影響；B：不同濃度的硫酸銨(mmol/L)對PE-GS基因表達的影響；C：不同濃度的硫酸銨(mmol/L)對PE-GS基因表達的影響；D：不同濃度的尿素(mmol/L)對PE-GS基因表達的影響

圖3不同培養條件下PE-GS基因表達量的變化

Figure 3 Transcription ofPE-GSunder different culture conditions

2.3 不同氮源濃度下PE-GS基因表達水平

2.3.1 不同氮源類型對PE-GS基因表達水平的影響。從圖3-A中可以看出，相同濃度下硫酸銨、硝酸鈉和尿素對PE-GS基因表達水平影響并不一致，強弱順序為：硝酸鈉>尿素>硫酸銨，說明PE-GS基因的表達水平受到氮源形式的影響，在氮源較易利用的情況下表達水平下調，反之則上調。

3 討論

目前，杏鮑菇的測序基本完成，通過序列對比，挖掘更多的GS基因。利用基因干擾、敲除、過表達，深入研究杏鮑菇中的營養代謝(氮素代謝)相關基因，為食用菌的高產打下基礎，是我們下一步的研究計劃。

4 結論