三疣梭子蟹蛻皮周期及眼柄切除后血淋巴甲基法尼酯濃度測定及其合成酶基因的表達分析

邵 娟, 鄭 亮, 鄭宏坤, 謝 熙, 朱冬發

(寧波大學 海洋學院， 寧波 315211)

周期性的蛻皮對于節肢動物的生長發育至關重要，其調控機理和分子機制也一直是內分泌學研究的熱點[1]。在昆蟲中，其蛻皮過程除受到蛻皮激素的密切控制之外，還需要萜類激素保幼激素(Juvenile hormone，JH)的協同調控，JH的存在可以阻止昆蟲幼體提前發生變態[2]。雖然甲殼動物的蛻皮過程也受到蛻皮激素的啟動和控制，但由于缺乏JH存在的證據[3]，甲殼動物中JH的對等物——甲基法尼酯(Methyl fanesoate，MF)在蛻皮過程中的作用受到了廣泛關注。

MF是一種JH III的非環氧化物，Laufer等最早在蜘蛛蟹(Libiniaemarginata)血淋巴中發現MF[4]，并隨后確定其合成分泌器官為大顎器(Mandibular organ，MO)[5]。此后各國學者相繼在不同甲殼動物物種中證實了MF的存在，相關的功能研究也表明其與JH一樣具有多效性，廣泛參與調控甲殼動物的各項生理過程[3]。多組證據表明MF可能參與甲殼動物的蛻皮調控：注射MO提取物或外源MF能夠加速甲殼動物的蛻皮[6-10]；干擾MF合成關鍵酶FAMeT基因的表達則能夠導致南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)蛻皮失敗并最后死亡[11]。Tamone和Chang[12]發現MF或MO提取物能夠刺激離體培養的普通黃道蟹(Cancerpagurus)Y器外植體分泌更多的蛻皮激素，表明MF可能通過刺激Y器中蛻皮激素的合成進而調控蛻皮。Ghanawi和Saoud[13]在紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)中也得到了類似的結果。但另一方面，Byard等[14]發現，摘除美洲海螯蝦(Homarusamericanus)大顎器后，成體雌蝦的蛻皮周期并無改變；Felterman和Zou[15]發現外源MF對招潮蟹(Ucapugilator)表皮組織蛻皮激素信號啟動無影響。總之，MF 對甲殼動物蛻皮的調控可能因物種、蛻皮階段和MF 劑量的不同而有所不同。

MF的生物合成遵循法尼焦磷酸/異戊烯(Farnesyl diphosphate/isopentenoid)途徑[16]，在經一系列催化反應合成法尼酸(Farnesoic acid，FA)后，FA在昆蟲中經酯化和環氧化形成JH III，而在甲殼動物中則僅發生酯化生成MF[17-18]。一直以來，法尼酸甲基轉移酶(Farnesoic acidO-methyltransferase，FAMeT)被認為是甲殼動物FA酯化反應的催化酶。但近年來，昆蟲保幼激素甲基轉移酶(JHAMT)的同源序列相繼在蚤狀溞(Daphniapulex)[17]和多齒新米蝦(Neocaridinadenticulata)[19]等甲殼動物中得到鑒定。課題組之前也對三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的JHAMT進行了基因克隆和功能分析，發現其可能也參與MF的生物合成[20]。此外，昆蟲中環氧化酶CYP15A1的同源序列最近也在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)中被發現[21]，其是否能夠催化甲殼動物MF發生環氧化還需進一步研究。目前，有關MF生物合成的調控機制并不明確，但眼柄因子肯定參與其中，眼柄切除(Eyestalk ablation，ESA)可以導致甲殼動物MO發生一系列細胞和生理生化變化，提升MF的合成分泌速率[3]。眼柄神經肽類激素大顎器抑制激素(Mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH)被認為是主要的MF合成抑制激素，但也有觀點認為眼柄中可能存在多種因子調控MF的生物合成活性[22]。

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我國東南沿海一種重要的經濟蟹類，但其人工增養殖過程中經常會出現“性早熟”及“蛻皮未遂”等現象，導致個體生長發育緩慢甚至死亡，帶來巨大的經濟損失。認識和闡明MF在三疣梭子蟹蛻皮及卵巢發育過程中的生理作用及調控機制，構建有效的基于MF的內分泌調控手段，對于從根本上解決這些問題具有重要的現實意義。本研究將對三疣梭子蟹蛻皮周期中及眼柄切除后的血淋巴MF含量變化進行檢測，并在已克隆獲得三疣梭子蟹AACT[23]、HMGR、FPS[24]、FAMeT和JHAMT全長cDNA序列的基礎上，分析這些MF合成重要酶類的基因表達情況，探討MF在三疣梭子蟹蛻皮過程中的作用及其可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

采集野生三疣梭子蟹(體質量: 45～80 g)，暫養于寧波市寧海縣得水育苗場。養殖池水溫不加任何控制, 依賴于自然溫度和光照，每日更換1/2海水，并喂食鮮活蟶子。參照沈潔等[25]的方法，根據形態學特征變化，將三疣梭子蟹蛻皮周期劃分為蛻皮后期(A、B期)、蛻皮間期(C)、蛻皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亞期)和蛻皮期(E)共4個階段。快速解剖各期(E期除外)三疣梭子蟹大顎器轉移至RNA保存液(上海生工)-20℃保存待用，并收集血淋巴用于檢測MF含量。各蛻皮期分別取5只蟹作為生物學重復。

1.2 方法

1.2.1 眼柄切除實驗

選取處于蛻皮間期(體質量: 35～50 g)的三疣梭子蟹并將其分為兩組：一組為對照組，不進行任何處理；另一組用鋒利的滅菌剪刀剪去其雙側眼柄之后，迅速用燒紅的鑷子對其傷口進行燒灼，以減少血淋巴流失和防止細菌感染。于眼柄切除后第0、1、2、4和第8天分別從各組隨機挑選5個個體進行取樣，解剖其大顎器轉移至RNA保護液(上海生工)中-20℃保存待用，并收集血淋巴用于檢測MF含量。

1.2.2 總RNA的提取及反轉錄

將組織樣品從RNA保存液中轉移至裝有300～500 μL(根據組織塊大小而定) Trizol(上海生工)的1.5 mL離心管中，用高速電動研磨棒對組織進行充分研磨后，補足Trizol至1 mL并室溫靜置5 min。將組織勻漿放入4℃冷凍離心機中12 000 r/min離心15 min后，吸上清液至新的離心管中，之后按照Trizol試劑說明書依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇進行抽提和洗滌，并進行干燥。RNA沉淀用RNAase-Free水溶解之后，加入DNase I移除基因組DNA。最后用電泳檢測RNA完整性，并用Nanodrop 2000C(Thermo Fisher)超微量分光光度計檢測RNA純度。取1 μg 大顎器總RNA，按照PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書合成第一鏈cDNA。

1.2.3 基因表達水平檢測

根據已獲得的AACT、HMGR、FPS、FAMeT及JHAMT的cDNA同源序列，設計熒光定量(qPCR)引物(表1)，利用qPCR對各基因的表達水平進行分析。按照SYBR? Premix ExTaqTM II (Perfect Real Time，TaKaRa)里的體系進行PCR擴增，同一cDNA重復3次。qPCR條件為：95℃預變性2 min；95℃變性5 s、58.2℃退火20 s、68℃延伸20 s，共40個循環。擴增結束后進行溶解曲線分析確保產物的特異性，其程序設定為25 min的55℃至95℃的升溫。由于三疣梭子蟹的beta-actin基因在實驗室之前研究中均能穩定表達，其被用于對本文目的基因的相對表達水平進行均一化。各樣品中目的基因的相對表達量用2-△△Ct法進行計算，以其中一個樣品中的表達水平為參照，其他樣品中的表達水平則以其倍數表示。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.2.4 血淋巴MF含量測定

利用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)中的選擇離子監測模式(SIM)對血淋巴中MF含量進行檢測，樣品前處理及具體實驗方法參照Xie等[26]。

1.2.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 蛻皮周期中血淋巴MF含量變化

在三疣梭子蟹的蛻皮周期中，血淋巴MF含量在蛻皮后期處于較低的水平，之后在蛻皮間期有所上升，但差異并不顯著(P>0.05)。血淋巴MF含量在蛻皮前期D0亞期顯著上升(P<0.05)，至D1亞期升至最高；隨后其迅速下降至低水平，但在D4亞期(即將蛻皮)又回升至較高的水平(圖1)。

2.2 蛻皮周期中PtAACT、PtFPS及PtJHAMT基因的表達變化

PtAACT、PtFPS和PtJHAMT3個MF合成酶在蛻皮周期中的基因表達模式并不相同(圖2)。PtAACT從A期開始逐漸上升，至C期升至最大，之后維持在較高的水平。PtFPS在B期升至最大后在C期迅速回落，并在D0期繼續下降至最低；之后又逐漸上升，但在D4期稍有回落。PtJHAMT則主要在D1期顯著上升，而在其他各期的表達水平均無顯著差異。

不同字母表示差異性顯著(P<0.05)。下同

圖1三疣梭子蟹蛻皮過程中血淋巴MF濃度變化

Figure 1 Change in Hemolymph MF titer during the molt cycle ofP.trituberculatus

圖2 PtAACT、PtFPS和PtJHAMT在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達水平變化

2.3 眼柄切除前后血淋巴MF含量變化

為了研究眼柄神經肽類激素與三疣梭子蟹MF合成的關系，我們對ESA處理后三疣梭子蟹血淋巴MF含量及相關合成基因的轉錄水平的變化進行了檢測。與未處理對照組(Intact)相比，三疣梭子蟹血淋巴MF含量在ESA后2～4 d急劇上升，但在ESA后第8天回復至正常水平(圖3與對照組無顯著差異，P>0.05)；同時，我們還檢測到在ESA后第8天時，對照組三疣梭子蟹血淋巴MF含量與第0天相比，也有顯著提升(圖4)，這反映了三疣梭子蟹在正常蛻皮周期中血淋巴MF的含量變化。

“*”表示與同步對照組的差異顯著(P<0.05)；不同字母表示ESA或對照組內各組的差異顯著(P<0.05)

圖3 ESA對三疣梭子蟹血淋巴MF含量的影響

Figure 3 Effect of ESA on the hemolymph MF titer ofP.trituberculatus

“*”表示各基因表達水平與其未處理組(0 d)的差異顯著(P<0.05)

圖4 ESA對三疣梭子蟹MF合成相關酶基因表達水平的影響

Figure 4 Effect of ESA on the expression of genes encodes the enzymes in MF synthesis pathway

2.4 眼柄切除后PtAACT、PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT及PtJHAMT基因的表達變化

我們進一步研究了ESA對5個MF合成關鍵酶基因表達的影響，除PtAACT外，PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT及PtJHAMT在MO中的基因表達水平均受到ESA的誘導(圖5)。但不同基因對ESA的響應程度并不一致：PtJHAMT上調最為明顯，其在ESA后第2和第4天分別上調了4.53和7.09倍；PtFPS在ESA后第2和第4天分別上調了2.02和3.69倍；PtHMGR則在ESA后第2和第4天分別上調了1.74和2.49倍；而PtFAMeT僅在ESA后第4天上調了1.75倍。

3 討論

三疣梭子蟹血淋巴MF濃度水平在蛻皮后期和間期較低，而在蛻皮前期逐漸增加至D1亞期達到高峰，這與羅氏沼蝦(M.rosenbergii)蛻皮周期中血淋巴MF水平變化[27]相似。Laufer等也報道了克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)血淋巴MF含量在蛻皮前期上升[10]。三疣梭子蟹血淋巴MF含量高峰的出現要早于蛻皮激素含量的高峰[28]，這也與Laufer等報道的結果一致[10]。這些結果再次預示MF可能通過促進蛻皮激素的合成來調控蛻皮。此外，本研究還發現三疣梭子蟹血淋巴MF含量在D4亞期(即將蛻皮)又顯著升高，類似的結果之前并未見報道，這可能是由于分期的方法和取樣的時機不盡相同。MF這種濃度水平的升高是否與蛻皮行為的發生抑或有其他的生理意義還需進一步評估。

實驗室之前曾報道了MF合成關鍵酶PtHMGR和PtFAMeT在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達變化，其表達水平分別在蛻皮前期D0亞期和D1亞期達到最高[29-30]。由于PtHMGR是MF合成早期酶類，其表達上調較早，而PtFAMeT是MF合成晚期酶類，故其表達高峰與血淋巴MF含量高峰的時期一致。本研究進一步研究了PtAACT、PtFPS和PtJHAMT等合成酶基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達變化，結果表明它們同樣對于MF的合成至關重要。特別是PtJHAMT，其基因表達水平在D1期升至最高，與PtFAMeT表達水平及血淋巴MF含量水平的變化均保持一致。PtAACT的表達水平則在蛻皮間期(C期)顯著升高，早于PtHMGR在D0期的高表達，其可能催化合成更多的乙酰CoA，為后來HMGR等的催化作用提供更多底物，從而促進MF的合成。PtAACT在整個蛻皮前期一直處于較高的水平，說明三疣梭子蟹MO在該過程中維持了較高的乙酰基代謝活性，這可能具有其他的生物學意義。作為MF合成甲羥戊酸途徑中的最后一步酶，PtFPS表達水平在D1期的顯著升高可能和之前PtAACT和PtHMGR的表達上調有關，但是這無法解釋PtFPS在蛻皮后期(B期)的最高表達水平。由于FPS可被二價陽離子激活，而甲殼動物在蛻皮后期大量吸收海水會導致體內相關金屬離子增多，這可能是PtFPS在蛻皮后期高表達的原因。總之，雖然這些MF合成酶基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的表達模式存在時序差異，但基本與各自在MF合成途徑中的位置相符合，這也表明MF合成酶的轉錄調控可能存在級聯效應。

早期的組織學觀察和生理生化實驗均表明ESA對甲殼動物MO的形態及MF合成分泌活性均有顯著的影響[3]，本研究中ESA能夠快速提升三疣梭子蟹血淋巴MF含量也進一步驗證了這一結論。在美洲海鰲蝦(H.americanus)中，ESA不僅能夠誘導FAMeT和HMGR酶活的上升，對其mRNA水平也有顯著的刺激作用[24]，這說明眼柄因子對MF的生物合成存在轉錄水平的調控。本研究也得到了類似的結果，PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT和PtJHAMT在三疣梭子蟹MO中的表達水平均在ESA后顯著上升。然而，ESA對這些基因轉錄活性的誘導效果并不相同，PtJHAMT對ESA的響應最為明顯，其表達量上調的倍數與血淋巴MF含量上升的倍數相似，再一次說明了其在MF生物合成中的重要作用。此外，PtAACT的表達并未受到ESA的影響，這說明MO的乙酰基代謝并不受到眼柄神經肽類激素的調控。

MOIH一直被認為是眼柄中抑制MO活性的主要神經肽類激素，其活性肽段在蜘蛛蟹(L.emarginata)[31]、普通黃道蟹(C.pagurus)[32]和美洲海鰲蝦[24]等物種中得到鑒定。美洲海鰲蝦的MOIH活性片段可以顯著抑制其MO中FAMeT的酶活及基因表達，但對HMGR的酶活及其mRNA水平卻無明顯影響，說明眼柄中可能存在多種因子調控MO的合成分泌活性[24]。這也能夠部分解釋ESA對MF合成酶基因表達水平的不同影響。

4 結論

本文對三疣梭子蟹蛻皮周期中MF的血淋巴含量和PtAACT、PtFPS和PtJHAMT的MF合成關鍵酶基因的表達進行了檢測，結果發現MF的血淋巴含量變化與3個基因的表達水平變化存在相關性，且3個基因的表達模式基本符合它們在MF合成通路中的位置關系，表明MF合成酶的轉錄調控可能存在級聯效應。通過眼柄切除(ESA)進一步研究了眼柄因子對MF生物合成的調控作用，結果發現ESA能夠迅速提升血淋巴MF含量和PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT和PtJHAMT等基因的表達水平，這說明眼柄因子對MF的生物合成存在轉錄水平的調控。