皮膚組織工程進(jìn)化與三維組織打印技術(shù)的機(jī)遇及挑戰(zhàn)

太光平, 吳 克, 蔡敬民

(1. 生物增材制造安徽省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 先進(jìn)生物制造中心， 合肥 230601; 2. 合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系， 合肥 230601)

組織工程皮膚是創(chuàng)面處理非手術(shù)治療的主要手段。本文綜述皮膚組織工程產(chǎn)品的發(fā)展，總結(jié)現(xiàn)有工程種子細(xì)胞和新型生物打印墨水材料, 重點(diǎn)介紹新型三維組織打印技術(shù)及多能干細(xì)胞在三維打印皮膚組織工程中的應(yīng)用。

1 皮膚組織工程產(chǎn)品發(fā)展

19世紀(jì)80年代，美國EW Lee博士最先嘗試合成類皮膚替代物[1]。到20世紀(jì)50—70年代人們開始探索應(yīng)用合成聚氨酯及去細(xì)胞化組織作為燒傷患者創(chuàng)面的保護(hù)屏障[2-3]。而里程碑式的進(jìn)展是Green在1975年首創(chuàng)的角朊細(xì)胞培養(yǎng)方法, 以及自體上皮細(xì)胞片培養(yǎng)技術(shù) CEAs(Cultured epithelial autografts)[4]。后期開發(fā)設(shè)計的多種新型人工皮膚, 特別是含活細(xì)胞人工皮膚，顯示較好的促傷口愈合結(jié)果。根據(jù)人工皮膚的組成或功能特性,可以分為化學(xué)合成類與天然脫細(xì)胞支架類人工皮膚、含細(xì)胞類與不含活細(xì)胞類人工皮膚[5-6]、異體活細(xì)胞類和自體活細(xì)胞類人工皮膚[7]及臨時性或永久性人工皮膚[7-8]。

早期的商業(yè)類產(chǎn)品主要是化學(xué)合成類與天然脫細(xì)胞支架類人工皮膚。如Alloderm, Matriderm? 及 Hyalomatrix[6,10]。其中, Matriderm?是一種牛源性非交聯(lián)凍干材料, 用于皮膚傷口的臨時覆蓋。后期研發(fā)的商業(yè)類產(chǎn)品添加有異體新生兒包皮成纖維細(xì)胞，如Apligraft、Stratagraft、Dermagraft 等同種異體細(xì)胞人造皮膚, 移植后其最終逐漸被排異，而只有添加了自體細(xì)胞的人工皮膚如EpiCel、ReCel類人工皮膚[5]其自體成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞能夠永久地融合入患者皮膚傷口。圖1顯示21世紀(jì)人工皮膚替代產(chǎn)品的發(fā)展及重要?dú)v史節(jié)點(diǎn)。

1.1 無細(xì)胞的人工合成皮膚

最早具有代表性的化學(xué)合成類人工皮膚為Biobrane，由合成尼龍網(wǎng)和交聯(lián)豬真皮組成。臨床研究表明，Biobrane 優(yōu)于燒傷臨床常規(guī)的磺胺嘧啶銀制劑[10]。其他人源天然脫細(xì)胞支架人工皮膚包括Alloderm和Dermamatrix，比動物源性的脫細(xì)胞人工皮膚好,其避免了動物(豬)源性病毒感染的風(fēng)險[11]。這一類人工皮膚中值得一提的是由Burke等在1981年開發(fā)的Integra[12-13]。Integra是由層狀多孔的化學(xué)交聯(lián)的牛膠原蛋白和鯊魚硫酸軟骨素組成, 其上層由有機(jī)硅層覆蓋。 Integra 處理的傷口在2～3周內(nèi)顯示良好的血管化。盡管該類皮膚替代品相對便宜，但其組織相容性有限，臨床效果較后期研發(fā)的天然脫細(xì)胞支架人工皮膚差。

1.2 含活細(xì)胞人工皮膚

通過增加同種異體活細(xì)胞(主要為上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞)的合成皮膚在燒傷傷口治療中顯示更快上皮化。這類包括添加異體或自體皮膚細(xì)胞的皮膚替代品。

1.2.1 異體活細(xì)胞人工皮膚

TransCyte[14]是最早開發(fā)的, 添加了新生兒成纖維細(xì)胞的Alloderm，含成纖維活細(xì)胞分泌沉積的生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分。TransCyte獲得FDA許可用于燒傷治療。該類皮膚還包括 ICX-Skin (英國), 也添加有新生兒成纖維細(xì)胞[15]。而Dermograft使用了可吸收聚乙二醇-聚乳酸共聚物支架及新生兒成纖維細(xì)胞，其可保存在-80℃, 當(dāng)植入傷口后，成纖維細(xì)胞開始增殖并分泌多種生長因子, 而聚乙二醇酸支架可在移植后3～4周被機(jī)體自然吸收[16]。 Apligraft代表了一種 “復(fù)合人工皮膚”, 其主要基于牛 I型膠原及新生兒成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞。Apligraft 保質(zhì)期短， 僅為5天,在1998年也被FDA批準(zhǔn)用于慢性靜脈性潰瘍和糖尿病腿部潰瘍的治療[6-7]。

1.2.2 自體活細(xì)胞類人工皮膚

Bell 在1981年首創(chuàng)一款基于自體活細(xì)胞的人工皮膚PermaDerm，使用了膠原蛋白并添加自體成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞[17]。PermaDerm在大鼠模型上移植后9天內(nèi)可形成基底膜,可覆蓋比原供體面積大66倍的燒傷創(chuàng)面[18]。其他產(chǎn)品還有應(yīng)用透明質(zhì)酸基質(zhì)，聯(lián)合應(yīng)用自體表皮及成纖維細(xì)胞的人工皮膚Orcel，以及簡單地把培養(yǎng)自體上皮細(xì)胞附著在石蠟紗布的EpicelTM[19-22]。雖然以上幾大類別的人工皮膚產(chǎn)品都已經(jīng)有了多種商業(yè)化產(chǎn)品，但臨床效果參差不齊，各個產(chǎn)品功效與臨床實(shí)際要求仍然有一定距離。尤其是缺乏多種天然皮膚重要的功能單元及細(xì)胞成分： 如汗腺細(xì)胞、黑素細(xì)胞和朗格漢細(xì)胞等, 脂肪組織和神經(jīng)感受細(xì)胞基本不存在。因此, 這些人工合成皮膚產(chǎn)品無法提供溫度控制、免疫調(diào)節(jié)和壓力感受功能。另一個限制因素是制造成本較高，如無細(xì)胞類人工合成皮膚Alloderm和Integra的市場價格約為每平方厘米15～30 美元，異體成纖維細(xì)胞類人工合成皮膚TransCyte和DermaMatrix的銷售價格為每平方厘米30～60美元，而含自體活細(xì)胞人工復(fù)合皮膚EpicelTM覆蓋每1% 的體表燒傷面積的成本超過13 000美元[5]。臨床和市場迫切需要價格更便宜, 功能更好的促傷口愈合的新型活細(xì)胞人工合成皮膚。設(shè)計新型皮膚替代品，增加皮膚功能細(xì)胞種類(比如血管內(nèi)皮細(xì)胞和毛囊細(xì)胞)，添加特定的細(xì)胞外基質(zhì)(III型膠原及透明質(zhì)酸)，引進(jìn)新興3D生物打印技術(shù)，是高精準(zhǔn)打印皮脂腺和毛囊，打印微血管網(wǎng)等皮膚功能單元成分，實(shí)現(xiàn)人工制造仿自然復(fù)合人工皮膚組織工程產(chǎn)品的必經(jīng)之路。

2 三維生物打印技術(shù)在皮膚組織工程中的應(yīng)用

基于3D打印技術(shù)的再生醫(yī)學(xué)及組織工程，已經(jīng)成為繼人類基因組大規(guī)模測序完成之后，生命科學(xué)及健康領(lǐng)域中最活躍的發(fā)展領(lǐng)域之一。3D生物打印以計算機(jī)三維模型為圖紙，利用特制生物墨水，裝配種子細(xì)胞，最終打印具有活性的人體細(xì)胞組織和器官，可在將來大面積填補(bǔ)器官移植的缺口。

經(jīng)典3D打印機(jī)根據(jù)打印材料的不同分為化學(xué)聚合、光敏聚合、黏合劑黏合；不同的打印技術(shù)路線分為擠出式、激光打印和噴墨打印等。3D生物打印目前應(yīng)用較多的主要有3種：包括噴墨、擠出式和激光輔助細(xì)胞打印[24]。每種技術(shù)都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性。圖2比較了主要3D生物打印技術(shù)的分辨率及生物墨水材料/細(xì)胞微觀尺度。

1)噴墨生物打印技術(shù)能夠快速地把含細(xì)胞的墨滴精確地打印到設(shè)計的位置。其特征是能高速地把活體細(xì)胞一層一層地打印，主要優(yōu)勢是可實(shí)現(xiàn)高速度, 但是由于噴墨的打印頭不能擠出高黏度材料, 所以不適用于高密度細(xì)胞的打印[25]。

2)擠出式生物打印在商用3D生物打印機(jī)中得到了廣泛的應(yīng)用[26-28]。生物墨水材料通過噴嘴擠出。基于擠出的原理異同分為: (a) 氣動式，其中分無閥和有閥； (b) 機(jī)械式擠出，包括螺桿驅(qū)動式擠出和電磁微閥式擠出，擠出噴頭支持的打印墨水黏度范圍較小。與紫外光照/化學(xué)和熱交聯(lián)結(jié)合后。擠出式生物打印系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)接近5～50 μm的分辨率。其缺點(diǎn)包括擠出式應(yīng)用的機(jī)械應(yīng)力會損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞活力。在皮膚組織生物打印領(lǐng)域，Lee[29-30]報告了3D打印多層人皮膚成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，使用了由氣體驅(qū)動的氣動微型噴嘴式擠出的逐層組裝工藝。Cubo[31]應(yīng)用擠出式3D生物打印，打印由人原代上皮細(xì)胞和原代成纖維細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合人工皮膚，移植裸鼠后顯示良好的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)。

3)激光輔助生物打印(Laser assisted bioprinting；LaBP)技術(shù)也已應(yīng)用于人工皮膚打印。Michael[32]應(yīng)用膠原做打印墨水，打印包括小鼠成纖維細(xì)胞和人源性永生化上皮細(xì)胞至Matriderm?脫細(xì)胞基質(zhì)上制備復(fù)合人工皮膚，該雜合人工皮膚移植裸鼠后顯示類似皮膚的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)；Koch 等[33-34]應(yīng)用激光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移 (Laser-induced forward transfer， LIFT)技術(shù)打印人工皮膚, 增殖和凋亡活性分析表明98%的成纖維細(xì)胞和約90%的人間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在激光轉(zhuǎn)移打印步驟中存活。基于激光打印提供了優(yōu)良的高分辨率，但目前打印速度相對緩慢，每小時僅能打印1 cm2皮膚組織。與擠出式生物打印技術(shù)相比, 激光輔助打印是非接觸式打印, 不會對細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致的細(xì)胞損傷及活力下降。此外， 激光輔助打印可以打印高黏性墨水材料，但激光的生物打印機(jī)器成本較高。

該領(lǐng)域最新發(fā)展的是原位皮膚打印。Hakimi等[23]開發(fā)了一種手持式3D 生物打印機(jī), 能夠在小鼠和豬傷口模型中直接打印皮膚，細(xì)胞能在傷口原位形成皮膚片。

圖1 皮膚組織工程的發(fā)展及關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)化重要時間點(diǎn)[23]

圖2 主要生物打印技術(shù)的分辨率及生物材料細(xì)胞微觀尺度比較[2，12]

注：噴墨、激光輔助和擠出式生物打印機(jī)制與分辨率進(jìn)行了比較。掃描電子顯微鏡(a)、(b)、(c)、(d) 的照片版權(quán)屬于原作者經(jīng)授權(quán)使用[8，18]

當(dāng)前三維生物打印人工皮膚還處于技術(shù)摸索階段。目前報道的三維生物打印人造皮膚尚未添加皮脂腺、毛囊細(xì)胞和微血管網(wǎng)等皮膚功能單元成分。

4)皮膚生物打印需要將不同打印技術(shù)的優(yōu)勢結(jié)合起來，在滿足高分辨率的同時兼顧高通量的要求。Cadau 等[35-36]報道了一個新的NGB 激光生物打印機(jī)，應(yīng)用了激光打印噴頭和噴墨打印噴頭，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)10 μm 的分辨率。該激光打印頭和噴墨打印頭打印的皮膚模型已經(jīng)用于化合物的高通量毒理篩選及化妝品成分的功能篩選。Kim等[37]則開發(fā)了一種擠出和噴墨聯(lián)合雙打印頭系統(tǒng)，擠出模塊用于打印成纖維細(xì)胞，噴墨模塊用于高速均勻打印上皮細(xì)胞。同時采用聚己內(nèi)酰胺復(fù)合的膠原打印墨水，該打印系統(tǒng)打印的人工皮膚移植14 d后能形成良好的表皮層。同時，該雙噴頭系統(tǒng)的使用大大地降低了打印材料墨水的用量，從而降低了皮膚制造成本。

圖 3 現(xiàn)有3D打印人工皮膚細(xì)胞類型及潛在可應(yīng)用的功能性細(xì)胞類型[31]

注：a為3D打印人工皮膚的組織學(xué)使用了a′原代成纖維細(xì)胞和原代人上皮細(xì)胞; b′為潛在的可用于皮膚打印的種子細(xì)胞; b為皮膚細(xì)胞模型圖。Epp (Epithelia) De (dermis) 標(biāo)尺: 100 μm

3 皮膚組織應(yīng)用材料及技術(shù)

3.1 皮膚生物打印墨水材料

生物打印墨水制約著3D 打印分辨率和生物打印構(gòu)建組織質(zhì)量。生物打印墨水材料為種子細(xì)胞提供物理和生化微環(huán)境信號，可影響細(xì)胞極性, 控制細(xì)胞遷移。

脫細(xì)胞外基質(zhì)dECM (decelullar extracellular matrix)含有豐富的細(xì)胞生長分化信號, 有利于組織再生修復(fù)，基于脫細(xì)胞外基質(zhì)的墨水缺點(diǎn)是機(jī)械性能差, 該特性可通過添加聚己內(nèi)酰胺進(jìn)行優(yōu)化，已用于生物3D打印[38]。

其他潛在的皮膚生物打印墨水材料包括最近開發(fā)的具有高導(dǎo)電性的多聚糖生物打印材料，可利用其導(dǎo)電特性對培養(yǎng)的細(xì)胞或組織實(shí)施電刺激，用以促進(jìn)干細(xì)胞分化和傷口愈合[39]。其他材料包括特種相轉(zhuǎn)換水凝膠[40]和產(chǎn)氧水凝膠[41]已經(jīng)用作生物打印材料，其可對打印組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞微環(huán)境實(shí)現(xiàn)操控。而其它已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)組織工程的生物相容性材料，如低熔點(diǎn)瓊脂糖、Pluronic? F-127、殼聚糖、溫敏性、熱敏性、pH值敏感性水凝膠等，可單獨(dú)應(yīng)用或者混用可開發(fā)為潛在的皮膚生物打印墨水材料[42]。

3.2 皮膚組織工程種子細(xì)胞的選擇

原代自體成纖維細(xì)胞、永生化成纖維細(xì)胞系已在傳統(tǒng)皮膚組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用。但原代自體細(xì)胞來源受限，永生化成纖維細(xì)胞系其臨床價值有限。比如已報道的激光及擠壓式皮膚三維生物打印實(shí)驗(yàn)中, 使用了小鼠 NIH3T3 成纖維細(xì)胞和人源性永生化HaCat上皮細(xì)胞，其主要用于3D打印系統(tǒng)功能的驗(yàn)證，無臨床應(yīng)用價值。因此開發(fā)選擇適合3D打印并有臨床價值的種子細(xì)胞仍然需要進(jìn)一步探索。

3.2.1 應(yīng)用淺表新生兒成纖維細(xì)胞減少瘢痕的形成

成纖維細(xì)胞是真皮層的主要成分, 具有合成膠原、分泌生長因子、啟動傷口愈合的功能。真皮區(qū)域可進(jìn)一步分為上層真皮和下層網(wǎng)狀真皮。已發(fā)現(xiàn)上層真皮與下層真皮中成纖維細(xì)胞有異質(zhì)性[43-44]。在培養(yǎng)的人工皮膚中加入上層真皮成纖維細(xì)胞后顯示瘢痕形成減少。上層真皮顯示高III 型/I 型膠原比例, 下層真皮顯示低III型/I 型膠原比例。此外，有證據(jù)提示，選擇性使用新生兒淺層真皮成纖維細(xì)胞可能有利于皮膚再生并且減少瘢痕的形成。同時，同種異體新生兒上皮細(xì)胞由于其人類白細(xì)胞抗原分化程度低，從而可減少移植后的免疫排斥反應(yīng)性[45-46]。另一個有趣的現(xiàn)象是，口腔黏膜傷口的愈合是已知的唯一成人無疤痕愈合典型。盡管人口腔或傷口處始終存在一定程度的微生物，該無疤痕愈合機(jī)制目前仍然不清楚[47]。同時文獻(xiàn)顯示基于口腔上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的人工皮膚組織顯示良好的基底膜形成及上皮細(xì)胞分化，其中其創(chuàng)面高水平的透明質(zhì)酸水平與高水平III型膠原是否與創(chuàng)面無瘢痕愈合有關(guān)仍需研究[48]。

3.2.2 干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞用于皮膚生物打印

傳統(tǒng)的組織工程皮膚只提供了最基本的兩類細(xì)胞(上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞)。由于技術(shù)限制，難以添加更復(fù)雜的皮膚附屬器官細(xì)胞，如皮膚色素細(xì)胞和血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。而隨著干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步,比如可利用干細(xì)胞或iPSCs (induced pluripotent stem cells)分化獲取上述功能細(xì)胞以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，使恢復(fù)微血管形成成為可能。

脂肪源性干細(xì)胞ADSCs(Adipocyte-derived stem cells)能夠分泌血管生成因子，可增加微血管形成。Trottier等[49]采用傳統(tǒng)的3層皮膚模型, 證明ADSCs可替代成纖維細(xì)胞重建人工皮膚， ADSCs培養(yǎng)基可刺激皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成和細(xì)胞遷移, 分泌血管內(nèi)皮生長因子, 從而加速傷口愈合。

羊水源性干細(xì)胞AFS(Amniotic fluid-derived stem cells) 也可作為成纖維細(xì)胞的替代細(xì)胞。 Skardal等[50]發(fā)現(xiàn)與MSC治療的傷口相比, AFS細(xì)胞治療傷口的微血管密度和毛細(xì)血管直徑有明顯增加。AFS容易分離，染色體穩(wěn)定, 同時AFS細(xì)胞不會誘發(fā)免疫排斥,是一種潛在的人工皮膚種子細(xì)胞。

另一類潛在種子細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)，iPSCs的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)組織工程中細(xì)胞數(shù)量這一瓶頸，使得體外提供無限制細(xì)胞數(shù)量成為可能。皮膚成纖維細(xì)胞可重新編程逆向分化成為 iPSCs干細(xì)胞[51]。而iPSCs可以再重新分化為角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[52]、汗腺細(xì)胞[53]及其他任何相關(guān)功能細(xì)胞用于重建人工皮膚[54-55]。

4 三維生物打印網(wǎng)絡(luò)化血管人工組織

構(gòu)建組織工程血管樣網(wǎng)絡(luò)以確保營養(yǎng)供應(yīng)，促進(jìn)打印組織與宿主融合仍然為組織工程領(lǐng)域的主要難題。De等[56]報道構(gòu)建基于內(nèi)皮細(xì)胞的血管化微球體可以為血管化三維組織工程提供新策略。應(yīng)用成纖維細(xì)胞及脂肪組織衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞ADSC作為支持細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞可在微球體內(nèi)自發(fā)形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。Hendrickx[57]則用一種定制的水凝膠促進(jìn)組織工程結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的形成。Hreimendahl[58]報道了應(yīng)用犧牲材料的方法打印設(shè)計的血管網(wǎng)絡(luò)。

5 生物打印組織工程產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

生物打印技術(shù)與干細(xì)胞分化技術(shù)的結(jié)合使打印高度仿真人造皮膚成為可能。尚有許多臨床前試驗(yàn)及臨床批文需要完成，所有成分組件包括細(xì)胞、生物墨水和生物打印機(jī)系統(tǒng)都必須滿足安全、無菌、質(zhì)控方面的要求和監(jiān)管。工藝必須納入(Good manufacturing practice)規(guī)范管理, 生物打印機(jī)軟硬件及系統(tǒng)所有組件必需是臨床級而非目前實(shí)驗(yàn)室級別[59-60]。最近, 美國測試與材料學(xué)會ASTM (American society for testing and materials) 發(fā)布了材料添加劑制造標(biāo)準(zhǔn)[61]。美國食品和藥物管理局FDA發(fā)表了關(guān)于三維打印的指導(dǎo)原則，對醫(yī)療設(shè)備和產(chǎn)品使用添加成分提出要求。同時, ASTM國際委員會、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織技術(shù)委員會和英國標(biāo)準(zhǔn)研究所也出臺了組織工程產(chǎn)品要求標(biāo)準(zhǔn)[62]。中國食品藥品監(jiān)督管理局尚無關(guān)于三維打印產(chǎn)品的規(guī)范性文件。目前執(zhí)行的仍然是國食藥監(jiān)械[2007]76號國家《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品研究及申報相關(guān)要求》。其對組織工程產(chǎn)品中的生物技術(shù)部分(包括活細(xì)胞、生物活性成分等)參照《藥品注冊管理辦法》，對生物制品的相關(guān)要求目前還包括不低于300例的包含Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床試驗(yàn)等[63]。

6 存在的問題及展望

目前在開發(fā)皮膚替代品和新興技術(shù)方面，盡管傳統(tǒng)工藝皮膚組織工程進(jìn)步很大, 但當(dāng)前組織工程皮膚仍有問題待解決，如血管化和必要的皮膚附屬器和色素沉著等難題。隨著高精度的3D 生物打印技術(shù)的成熟, 更多的新型細(xì)胞或干細(xì)胞分化皮膚附件細(xì)胞可用于皮膚3D生物打印；創(chuàng)新材料比如具有導(dǎo)電特性的生物打印材料，可支持快速血管化, 并促進(jìn)創(chuàng)面皮膚愈合。