不同時期雌激素替代療法對行卵巢切除術大鼠血管內皮功能的影響研究

張倩榕，鄭小璞，李冰，高登峰

流行病學調查顯示，絕經后女性冠心病發病率明顯升高，其原因與失去雌激素保護有關［1］。雌激素替代療法（HRT）指對存在雌激素缺乏的絕經后婦女補充雌激素及孕激素以緩解其更年期癥狀的治療。近年來研究發現，HRT對絕經早期女性心血管系統有益，但對絕經晚期或年齡＞60歲女性心血管系統無益甚至有害［2］。因此，有學者提出HRT的“時間窗假設”，即HRT僅在絕經后一定時間內對心血管系統有益［3］。動脈粥樣硬化的特點是受累動脈病變從內膜開始，而一氧化氮（NO）對內皮細胞具有保護作用，是機體重要的內皮源性舒張因子，其在調節血管張力、抗動脈粥樣硬化過程中具有重要作用；一氧化氮合酶（NOS）是催化合成NO的重要酶，內皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表達于血管內皮細胞和心肌細胞，eNOS功能障礙可導致血管舒縮功能紊亂，冠狀動脈痙攣、血栓形成，進而促進冠心病發生發展。既往研究表明，雌激素可通過上調eNOS表達而促進NO生成，進而擴張血管［4-5］。本研究旨在探討不同時期HRT對行卵巢切除術大鼠血管內皮功能的影響，以探索HRT存在“治療時間窗”的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2017年4—7月，選取無特殊病原體（SPF）級健康SD雌性大鼠32只，月齡10～12個月，平均體質量（450±10）g，均購自西安交通大學醫學部動物部。飼養條件：室溫20～22 ℃，手術室溫27～28 ℃，相對濕度55%～60%。

1.2 主要試劑及儀器 離體組織器官恒溫灌流裝置（成都態盟科技有限公司生產，型號：SV-8），電子天平（德國賽多利斯公司生產，型號：BP221s），高速離心機（上海安亭科學儀器廠生產，型號：TGL-16G），透射顯微鏡（日本日立公司生產，型號：7650），體視顯微鏡（海光學儀器廠生產，型號：XTZ-E），eNOS、NO試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產）。

1.3 實驗方法 將SD大鼠依次編號，采用隨機數字表法分為正常對照組、無卵巢組、早期干預組及晚期干預組，每組8只。正常對照組大鼠于1周后給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d；去卵巢組大鼠于卵巢切除術后1周開始給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d；早期干預組大鼠于卵巢切除術后1周開始行HRT，1次/d；晚期干預組大鼠于卵巢切除術后16周開始行HRT，1次/d，4組大鼠均干預8周。HRT方法：8粒炔雌醇環戊醚（CEE）（0.625 mg/粒）+8粒醋酸甲基孕酮（MPA）（2 mg/粒）溶于0.9%氯化鈉溶液100 ml，相當于每2 ml液體中含0.1 mg CEE、0.32 mg MPA，每日灌胃容積=鼠體質量（g）/1 000×1.4。所有大鼠給予普通飼料并在統一環境下飼養，每周稱重1次，根據大鼠體質量調整灌胃容積。

1.4 卵巢切除術模型制備 模型制備大鼠于術前晚20∶00禁食過夜，不禁水，稱重，采用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功（肌肉松弛、角膜反射減弱、心跳呼吸平穩）后固定大鼠，背部備皮，安爾碘消毒，鋪洞巾，取腰背部切口進入，找到腰椎兩側腎后方小球狀卵巢，采用絲線結扎后切除，絲線雙層縫合關腹［6］。術后第5天行陰道細胞涂片，如動情周期消失則證明模型制備成功［7-9］。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清NO、eNOS水平 各組大鼠均于最后1次灌胃后采用10 ml注射器于腹主動脈根部穿刺動脈，抽取血液，將2 ml血液注入不抗凝干燥玻璃試管中，靜置30 min，血液凝固后3 000 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），分離血清并凍存于-20 ℃冰箱待測；采用硝酸還原酶法檢測血清NO、eNOS水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5.2 血管環制備及血管環舒張度檢測 抽取腹主動脈血后50 min內處死各組大鼠，取出胸主動脈，置于預冷的通有95%氧氣（O2）和5%二氧化碳（CO2）的改良K-H液（NaCl 118.3 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgSO44.7 mmol/L、H2O 1.2 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、glucose 11.1 mmol/L）冰水浴中漂洗，小心剪去血管周圍脂肪和結締組織，清除血管內血液，采用眼科剪將血管剪成3～4 mm血管環。采用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管環管腔，水平懸掛于盛有10 ml K-H液的器官浴管中，下方固定，上方用一細鋼絲與張力換能器相連。浴管中持續通有95%O2+5%CO2的混合氣體。調節最適前負荷至1.0 g，平衡90 min，期間更換K-H液，1次/15 min。待血管環穩定后將張力換能器系統調零，采用KCl（100 mmol/L）檢測血管環反應性，待收縮反應曲線至平臺期后沖洗3次后平衡20 min，張力基本恢復至基線，再次給予KCl（100 mmol/L），待收縮反應曲線至平臺期，比較2次收縮幅度。之后再次沖洗3次后給予1 μmol/L去氧腎上腺素（PE）預收縮血管，達峰值約10 min后采用累積濃度法依次給予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L乙酰膽堿（ACh），觀察血管張力變化。待累積反應穩定后沖洗3次，平衡至基線后，采用1 μmol/L PE再次收縮血管，血管收縮達峰值后采用累積濃度法依次給予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L硝普鈉，觀察血管張力變化。血管環舒張度以血管舒張張力占PE（1×10-6mol/L）引起收縮張力的百分比表示［10］。

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以（雙側）P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清NO、eNOS水平 干預后4組大鼠血清NO、eNOS水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；去卵巢組和晚期干預組大鼠血清NO、eNOS水平低于正常對照組，早期干預組大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢組和晚期干預組，晚期干預組大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 4組大鼠干預后血清NO、eNOS水平比較（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

表1 4組大鼠干預后血清NO、eNOS水平比較（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

注：NO=一氧化氮，eNOS=內皮型一氧化氮合酶；與正常對照組比較，aP＜0.05；與去卵巢組比較，bP＜0.05；與早期干預組比較，cP＜0.05

組別 只數 NO eNOS正常對照組 8 38.30±5.55 2.59±0.16去卵巢組 8 28.99±8.20a 2.10±0.88a早期干預組 8 36.70±5.30b 3.08±0.18b晚期干預組 8 5.60±0.55abc 1.09±0.06abc F值 57.63 27.77 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 血管環舒張度 干預后正常對照組大鼠血管環舒張度為（0.822±0.234）%，去卵巢組大鼠為（0.691±0.187）%，早期干預組大鼠為（0.890±0.074）%，晚期干預組大鼠為（0.756±0.146）%。4組大鼠血管環舒張度比較，差異有統計學意義（F=3.20，P=0.04）；去卵巢組大鼠血管環舒張度低于正常對照組，早期干預組和晚期干預組大鼠血管環舒張度高于去卵巢組，早期干預組大鼠血管環舒張度高于晚期干預組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

基礎及臨床試驗證實，雌激素對心血管具有保護作用，因此絕經前女性冠心病發病率較低，圍絕經期及絕經后女性冠心病發病率較高［1］。既往研究表明，雌激素缺乏是冠心病的獨立危險因素之一［11-13］，女性絕經前心血管疾病發生年齡較男性約晚10年，絕經后隨著雌激素水平降低，女性心血管疾病發生風險明顯升高［14］。

既往研究表明，絕經后合并高膽固醇血癥患者口服雌激素后纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI-1）和選擇素E水平降低［15］；WINGROVE等［16］研究表明，17β-雌二醇和雌激素可以抑制正常人冠狀動脈內皮細胞（CAEC）刺激內皮素1釋放的能力及eNOS表達能力。KOH等［17］研究表明，HRT能有效抑制纖維蛋白溶解及減少血管炎性標志物生成，故對心血管系統有益。此外，雌激素還可不依賴內皮細胞發揮作用，而是通過Ca2+通道促進血管舒張。KOH等［18］研究表明，Ca2+濃度增加可導致動脈環收縮，而增加雌二醇可以抑制動脈環收縮。既往研究還表明，雌二醇可抑制心肌細胞Ca2+內流，進而減少細胞內游離Ca2+［19］；同時，雌激素可以作用于BKCa通道而松弛冠狀動脈［20］。但有大型隨機雙盲對照試驗并不推薦HRT作為冠心病的一級預防藥物［21］。LEE等［22］研究結果顯示，絕經后一定時期內行HRT者冠心病發生概率明顯低于絕經后較長時間行HRT者，推測絕經后一定時間內雌激素具有心血管保護作用，即雌激素“治療時間窗”，但具體機制尚不明確。筆者所在課題組提出假設，女性隨著絕經時間延長其衰老及體內激素環境改變（如雌激素水平低下）導致雌激素受體表達、機體炎性反應相關因子活化受影響，雌激素在特定組織中的作用通路發生改變，進而導致機體免疫、血管等組織中eNOS、NO含量較低而無法有效維持血管內皮功能。

本研究通過制備卵巢切除術模型大鼠模擬女性絕經后狀態，并探討不同時期HRT對大鼠血管內皮功能的影響，結果顯示，干預后去卵巢組和晚期干預組大鼠血清NO、eNOS水平低于正常對照組，早期干預組大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢組和晚期干預組，晚期干預組大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢組；干預后去卵巢組大鼠血管環舒張度低于正常對照組，早期干預組和晚期干預組大鼠血管環舒張度高于去卵巢組，早期干預組大鼠血管環舒張度高于晚期干預組，提示早期HRT對卵巢切除術后大鼠血管內皮功能具有一定保護作用，而晚期HRT對卵巢切除術后大鼠血管內皮功能無保護作用，即HRT存在“治療時間窗”。

綜上所述，早期HRT對卵巢切除術后大鼠血管內皮功能具有一定保護作用，而晚期HRT對卵巢切除術后大鼠血管內皮功能無保護作用。本研究仍存在以下不足：（1）大鼠月齡為10～12個月，不能排除老齡對心血管的影響［23］；（2）由于研究經費及時間原因而未深入探討HRT存在“治療時間窗”的機制；（3）雌激素使用劑量及具體時間尚有待進一步研究。

作者貢獻：張倩榕、鄭小璞進行文章的構思與設計；張倩榕、李冰進行數據收集、整理、分析；張倩榕進行結果分析與解釋，負責撰寫論文；李冰負責文章的質量控制及審校；高登峰對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。