不同時(shí)期雌激素替代療法對(duì)行卵巢切除術(shù)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響研究

張倩榕，鄭小璞，李冰，高登峰

流行病學(xué)調(diào)查顯示，絕經(jīng)后女性冠心病發(fā)病率明顯升高，其原因與失去雌激素保護(hù)有關(guān)［1］。雌激素替代療法（HRT）指對(duì)存在雌激素缺乏的絕經(jīng)后婦女補(bǔ)充雌激素及孕激素以緩解其更年期癥狀的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HRT對(duì)絕經(jīng)早期女性心血管系統(tǒng)有益，但對(duì)絕經(jīng)晚期或年齡＞60歲女性心血管系統(tǒng)無益甚至有害［2］。因此，有學(xué)者提出HRT的“時(shí)間窗假設(shè)”，即HRT僅在絕經(jīng)后一定時(shí)間內(nèi)對(duì)心血管系統(tǒng)有益［3］。動(dòng)脈粥樣硬化的特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開始，而一氧化氮（NO）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，是機(jī)體重要的內(nèi)皮源性舒張因子，其在調(diào)節(jié)血管張力、抗動(dòng)脈粥樣硬化過程中具有重要作用；一氧化氮合酶（NOS）是催化合成NO的重要酶，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，eNOS功能障礙可導(dǎo)致血管舒縮功能紊亂，冠狀動(dòng)脈痙攣、血栓形成，進(jìn)而促進(jìn)冠心病發(fā)生發(fā)展。既往研究表明，雌激素可通過上調(diào)eNOS表達(dá)而促進(jìn)NO生成，進(jìn)而擴(kuò)張血管［4-5］。本研究旨在探討不同時(shí)期HRT對(duì)行卵巢切除術(shù)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，以探索HRT存在“治療時(shí)間窗”的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2017年4—7月，選取無特殊病原體（SPF）級(jí)健康SD雌性大鼠32只，月齡10～12個(gè)月，平均體質(zhì)量（450±10）g，均購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部。飼養(yǎng)條件：室溫20～22 ℃，手術(shù)室溫27～28 ℃，相對(duì)濕度55%～60%。

1.2 主要試劑及儀器 離體組織器官恒溫灌流裝置（成都態(tài)盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)：SV-8），電子天平（德國(guó)賽多利斯公司生產(chǎn)，型號(hào)：BP221s），高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)：TGL-16G），透射顯微鏡（日本日立公司生產(chǎn)，型號(hào)：7650），體視顯微鏡（海光學(xué)儀器廠生產(chǎn)，型號(hào)：XTZ-E），eNOS、NO試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將SD大鼠依次編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、無卵巢組、早期干預(yù)組及晚期干預(yù)組，每組8只。正常對(duì)照組大鼠于1周后給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d；去卵巢組大鼠于卵巢切除術(shù)后1周開始給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d；早期干預(yù)組大鼠于卵巢切除術(shù)后1周開始行HRT，1次/d；晚期干預(yù)組大鼠于卵巢切除術(shù)后16周開始行HRT，1次/d，4組大鼠均干預(yù)8周。HRT方法：8粒炔雌醇環(huán)戊醚（CEE）（0.625 mg/粒）+8粒醋酸甲基孕酮（MPA）（2 mg/粒）溶于0.9%氯化鈉溶液100 ml，相當(dāng)于每2 ml液體中含0.1 mg CEE、0.32 mg MPA，每日灌胃容積=鼠體質(zhì)量（g）/1 000×1.4。所有大鼠給予普通飼料并在統(tǒng)一環(huán)境下飼養(yǎng)，每周稱重1次，根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃容積。

1.4 卵巢切除術(shù)模型制備 模型制備大鼠于術(shù)前晚20∶00禁食過夜，不禁水，稱重，采用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功（肌肉松弛、角膜反射減弱、心跳呼吸平穩(wěn)）后固定大鼠，背部備皮，安爾碘消毒，鋪洞巾，取腰背部切口進(jìn)入，找到腰椎兩側(cè)腎后方小球狀卵巢，采用絲線結(jié)扎后切除，絲線雙層縫合關(guān)腹［6］。術(shù)后第5天行陰道細(xì)胞涂片，如動(dòng)情周期消失則證明模型制備成功［7-9］。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血清NO、eNOS水平 各組大鼠均于最后1次灌胃后采用10 ml注射器于腹主動(dòng)脈根部穿刺動(dòng)脈，抽取血液，將2 ml血液注入不抗凝干燥玻璃試管中，靜置30 min，血液凝固后3 000 r/min離心15 min（離心半徑13.5 cm），分離血清并凍存于-20 ℃冰箱待測(cè)；采用硝酸還原酶法檢測(cè)血清NO、eNOS水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.2 血管環(huán)制備及血管環(huán)舒張度檢測(cè) 抽取腹主動(dòng)脈血后50 min內(nèi)處死各組大鼠，取出胸主動(dòng)脈，置于預(yù)冷的通有95%氧氣（O2）和5%二氧化碳（CO2）的改良K-H液（NaCl 118.3 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、MgSO44.7 mmol/L、H2O 1.2 mmol/L、KH2PO41.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、glucose 11.1 mmol/L）冰水浴中漂洗，小心剪去血管周圍脂肪和結(jié)締組織，清除血管內(nèi)血液，采用眼科剪將血管剪成3～4 mm血管環(huán)。采用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管環(huán)管腔，水平懸掛于盛有10 ml K-H液的器官浴管中，下方固定，上方用一細(xì)鋼絲與張力換能器相連。浴管中持續(xù)通有95%O2+5%CO2的混合氣體。調(diào)節(jié)最適前負(fù)荷至1.0 g，平衡90 min，期間更換K-H液，1次/15 min。待血管環(huán)穩(wěn)定后將張力換能器系統(tǒng)調(diào)零，采用KCl（100 mmol/L）檢測(cè)血管環(huán)反應(yīng)性，待收縮反應(yīng)曲線至平臺(tái)期后沖洗3次后平衡20 min，張力基本恢復(fù)至基線，再次給予KCl（100 mmol/L），待收縮反應(yīng)曲線至平臺(tái)期，比較2次收縮幅度。之后再次沖洗3次后給予1 μmol/L去氧腎上腺素（PE）預(yù)收縮血管，達(dá)峰值約10 min后采用累積濃度法依次給予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L乙酰膽堿（ACh），觀察血管張力變化。待累積反應(yīng)穩(wěn)定后沖洗3次，平衡至基線后，采用1 μmol/L PE再次收縮血管，血管收縮達(dá)峰值后采用累積濃度法依次給予 1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L硝普鈉，觀察血管張力變化。血管環(huán)舒張度以血管舒張張力占PE（1×10-6mol/L）引起收縮張力的百分比表示［10］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以（雙側(cè)）P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清NO、eNOS水平 干預(yù)后4組大鼠血清NO、eNOS水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；去卵巢組和晚期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平低于正常對(duì)照組，早期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢組和晚期干預(yù)組，晚期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 4組大鼠干預(yù)后血清NO、eNOS水平比較（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

表1 4組大鼠干預(yù)后血清NO、eNOS水平比較（±s，μmol/L）Table 1 Comparison of serum levels of NO and eNOS in the four groups after intervention

注：NO=一氧化氮，eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶；與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與去卵巢組比較，bP＜0.05；與早期干預(yù)組比較，cP＜0.05

組別 只數(shù) NO eNOS正常對(duì)照組 8 38.30±5.55 2.59±0.16去卵巢組 8 28.99±8.20a 2.10±0.88a早期干預(yù)組 8 36.70±5.30b 3.08±0.18b晚期干預(yù)組 8 5.60±0.55abc 1.09±0.06abc F值 57.63 27.77 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 血管環(huán)舒張度 干預(yù)后正常對(duì)照組大鼠血管環(huán)舒張度為（0.822±0.234）%，去卵巢組大鼠為（0.691±0.187）%，早期干預(yù)組大鼠為（0.890±0.074）%，晚期干預(yù)組大鼠為（0.756±0.146）%。4組大鼠血管環(huán)舒張度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.20，P=0.04）；去卵巢組大鼠血管環(huán)舒張度低于正常對(duì)照組，早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組大鼠血管環(huán)舒張度高于去卵巢組，早期干預(yù)組大鼠血管環(huán)舒張度高于晚期干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

基礎(chǔ)及臨床試驗(yàn)證實(shí)，雌激素對(duì)心血管具有保護(hù)作用，因此絕經(jīng)前女性冠心病發(fā)病率較低，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性冠心病發(fā)病率較高［1］。既往研究表明，雌激素缺乏是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［11-13］，女性絕經(jīng)前心血管疾病發(fā)生年齡較男性約晚10年，絕經(jīng)后隨著雌激素水平降低，女性心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯升高［14］。

既往研究表明，絕經(jīng)后合并高膽固醇血癥患者口服雌激素后纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI-1）和選擇素E水平降低［15］；WINGROVE等［16］研究表明，17β-雌二醇和雌激素可以抑制正常人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（CAEC）刺激內(nèi)皮素1釋放的能力及eNOS表達(dá)能力。KOH等［17］研究表明，HRT能有效抑制纖維蛋白溶解及減少血管炎性標(biāo)志物生成，故對(duì)心血管系統(tǒng)有益。此外，雌激素還可不依賴內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用，而是通過Ca2+通道促進(jìn)血管舒張。KOH等［18］研究表明，Ca2+濃度增加可導(dǎo)致動(dòng)脈環(huán)收縮，而增加雌二醇可以抑制動(dòng)脈環(huán)收縮。既往研究還表明，雌二醇可抑制心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+［19］；同時(shí)，雌激素可以作用于BKCa通道而松弛冠狀動(dòng)脈［20］。但有大型隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)并不推薦HRT作為冠心病的一級(jí)預(yù)防藥物［21］。LEE等［22］研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后一定時(shí)期內(nèi)行HRT者冠心病發(fā)生概率明顯低于絕經(jīng)后較長(zhǎng)時(shí)間行HRT者，推測(cè)絕經(jīng)后一定時(shí)間內(nèi)雌激素具有心血管保護(hù)作用，即雌激素“治療時(shí)間窗”，但具體機(jī)制尚不明確。筆者所在課題組提出假設(shè)，女性隨著絕經(jīng)時(shí)間延長(zhǎng)其衰老及體內(nèi)激素環(huán)境改變（如雌激素水平低下）導(dǎo)致雌激素受體表達(dá)、機(jī)體炎性反應(yīng)相關(guān)因子活化受影響，雌激素在特定組織中的作用通路發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫、血管等組織中eNOS、NO含量較低而無法有效維持血管內(nèi)皮功能。

本研究通過制備卵巢切除術(shù)模型大鼠模擬女性絕經(jīng)后狀態(tài)，并探討不同時(shí)期HRT對(duì)大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，結(jié)果顯示，干預(yù)后去卵巢組和晚期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平低于正常對(duì)照組，早期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平高于去卵巢組和晚期干預(yù)組，晚期干預(yù)組大鼠血清NO、eNOS水平低于去卵巢組；干預(yù)后去卵巢組大鼠血管環(huán)舒張度低于正常對(duì)照組，早期干預(yù)組和晚期干預(yù)組大鼠血管環(huán)舒張度高于去卵巢組，早期干預(yù)組大鼠血管環(huán)舒張度高于晚期干預(yù)組，提示早期HRT對(duì)卵巢切除術(shù)后大鼠血管內(nèi)皮功能具有一定保護(hù)作用，而晚期HRT對(duì)卵巢切除術(shù)后大鼠血管內(nèi)皮功能無保護(hù)作用，即HRT存在“治療時(shí)間窗”。

綜上所述，早期HRT對(duì)卵巢切除術(shù)后大鼠血管內(nèi)皮功能具有一定保護(hù)作用，而晚期HRT對(duì)卵巢切除術(shù)后大鼠血管內(nèi)皮功能無保護(hù)作用。本研究仍存在以下不足：（1）大鼠月齡為10～12個(gè)月，不能排除老齡對(duì)心血管的影響［23］；（2）由于研究經(jīng)費(fèi)及時(shí)間原因而未深入探討HRT存在“治療時(shí)間窗”的機(jī)制；（3）雌激素使用劑量及具體時(shí)間尚有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：張倩榕、鄭小璞進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；張倩榕、李冰進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張倩榕進(jìn)行結(jié)果分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫論文；李冰負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；高登峰對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。