共振瑞利散射法測定透明質酸鈉

馮玲

摘要：本實驗研究了透明質酸鈉溶液和糜蛋白酶溶液相互作用的共振瑞利散射光譜，其最大散射峰為300nm，RRS的強度在一定濃度范圍內與透明質酸鈉溶液濃度呈良好的線性關系，本文同時討論了實驗適宜的反應條件以及共存物質對測定結果的影響，結果顯示該方法具有較好的靈敏度，且有較好選擇性，從而建立一種測定透明質酸鈉的新方法。該方法測定滴眼液中透明質酸鈉的含量，效果較好。

關鍵詞：糜蛋白酶；共振瑞利散射；透明質酸鈉

透明質酸鈉（Sodium hyaluronate，以下簡稱SH）可從雞冠中提取或通過乳酸球菌發酵獲得，SH是一種白色粉末狀固體，有時也呈纖維狀，具有較好的保濕性，能溶于水，不溶于乙醚、丙酮和乙醇等有機溶劑，無臭味，干燥時，氮含量為2.8%～4.0%，葡糖醛酸含量為37.0%～51.0%。是一種鏈狀的天然高分子多糖類物質，結構式如下：

以前在測定透明質酸鈉的方法上都有各自的優點和不足，本實驗擬采用共振瑞利散射法對透明質酸進行測定，來建立一種更為高效、準確的檢測方法。共振瑞利散射有如下的優點：①對稀溶液可進行測定，且靈敏度較高；②可操作性強，同時對RRS光譜的特征亦可進行研究。因其有較高的信號水平，可采用普通熒光光度計的普通光源作為發射光源，使普通光源通過單色器，形成波長連續的入射光，再經由普通熒光分光光度計同步掃描即可得到清晰完整的RRS光譜。整個實驗過程中使用普通的熒光分光光度計即可得到測定物質的RRS光譜，由于使用儀器的廉價，對該技術的普及使用也更加容易。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

日立F-2700型熒光分光光度計， 測定參數：狹縫5 nm；PHS-3C型精密PH計，校正溶液PH值。

1.2 實驗試劑

配制0.4 mg/mL的透明質酸鈉溶液。糜蛋白酶溶液：采用100 μg/mL的樣品。BR緩沖溶液：將0.04 mol/L H3PO4，H3BO3和CH3COOH混合一定比例的0.2 mol/L NaOH溶液，得到不同PH值的BR緩沖溶液，通過酸度計得出其PH值。該實驗使用的其余試劑濃度均達到分析純標準，使用二次蒸餾水作為實驗用水。

1.3 實驗方法

將PH=3.3的BR緩沖溶液1.0 mL、Chy溶液0.6 mL以及一定量的SH標準溶液加入10 mL的比色管中混合均勻，稀釋至刻度后再搖勻。靜置10 min后，用熒光分光光度計進行同步掃描（λex=λem）同時記錄以各自最大散射波長處測定樣品的共振瑞利散射光譜IRRS和試劑空白散射強度的共振瑞利散射光譜I0RRS，?IRRS=IRRS-I0RRS。

2 結果與討論

光譜特征

RRS光譜

以△λ=0 nm分別掃描SH溶液、Chy溶液以及SH-Chy體系溶液，得RRS光譜圖。通過觀察并分析光譜圖可得：單獨的SH溶液和Chy溶液其共振瑞利散射強度都很微弱，但當兩者混合后，相互作用形成復合物時，共振瑞利散射強度明顯增強，并在300 nm處產生一個清晰的散射峰。

通過研究不同濃度的SH溶液對Chy-SH體系RRS強度的影響，得到RRS光譜。從光譜圖可知：當SH concentration的濃度在0～1.0 μg/mL范圍內遞增時，Chy-SH體系的RRS強度在300 nm處依次增強，呈良好的線性關系。

適宜的反應條件

（1）酸度的影響。分別試驗了BR、HAc-NaAc等緩沖溶液對SH-Chy體系的影響，結果顯示BR緩沖液對體系的測定最佳，進一步優化BR緩沖液在不同PH值對該體系的影響。通過進行數據分析可知，當溶液PH在2.8～4.8時該體系的共振瑞利散射光譜的差值最大，本實驗選取PH=3.3的BR緩沖液1.0 mL進行實驗。

（2）糜蛋白酶濃度的影響。從結果可以看出Chy與SH反應在Chy濃度5.0～15 μg/mL時，Chy-SH體系的散射強度達到最大，以下實驗選用Chy濃度為6.0 μg/mL。

反應時間及穩定性

在上述的實驗條件和室溫下，考察了時間及該體系的穩定性，實驗結果顯示10 min內Chy溶液與SH溶液可完全反應，且在1h內其DIRRS的值較為穩定，所以當實驗反應10 min后再進行測定。

標準曲線

選擇最佳實驗反應條件，分別將不同濃度的SH溶液與Chy溶液進行混合，并在其最大波長處測定RRS的強度，通過使用該體系散射增強后的ΔIRRS值進行繪制透明質酸鈉濃度標準曲線。實驗結果表明該方法對透明質酸鈉的測定靈敏度較高、檢出限較好，其檢出限為4.33 ng/mL。

方法的選擇性

實驗研究了共存金屬離子、無機酸根、糖類、氨基酸等對該體系的影響。實驗結果表明以上物質在一定濃度范圍內對該體系不造成影響，該方法具有良好的選擇性。

3 分析應用

在10 mL比色管中加入稀釋后濃度為1.0 mL（0.01 mg/mL）的透明質酸鈉滴眼液，在最佳條件下對其進行測定，再向其中加入標準的透明質酸鈉溶液來檢驗該方法的回收率。分析實驗數據從而得出該方法具有較好的準確度和精密度。

4 結論

本實驗考察了透明質酸鈉溶液與糜蛋白酶溶液混合體系的共振瑞利散射光譜，建立了一種測定透明質酸鈉的新方法，該方法應用于滴眼液中透明質酸鈉含量的測定結果較好，令人滿意。

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（作者單位：四川省南充市高坪第七小學江東校區）