微柱凝膠免疫分析診斷新生兒免疫性血小板減少癥自身抗體的價值研究

王景順

(漯河醫學高等專科學校一附院(漯河市中心醫院)輸血科，河南 漯河 462000)

免疫性血小板減少癥是由于機體免疫功能失調而導致的血小板破壞增加或血小板生成減少，免疫性血小板減少癥包括原發性和繼發性兩種[1，2]。原發免疫性血小板減少癥即特發性血小板減少性紫癜（idopathi thrombocytopenic purpura，ITP），即無明確病因且有抗體介導的血小板被機體巨噬細胞系統所破壞以及無明確病因血小板生成受抑制[2]。在血小板減少孕婦中，ITP約占4%，患有ITP的孕婦其免疫球蛋白G（IgG）能夠形成自身抗體，而母體內的IgG自身抗體則能通過胎盤導致新生兒免疫性血小板減少癥 （Neonatal immune thrombocytopenia，NITP）[3]。 在疾病的診斷以及療效判定方面，血小板抗體檢測具有著重要作用，目前主要報道的檢測方法包括流式細胞儀（FCM）、簡易致敏紅細胞血小板血清學技術（SEPSA）、單克隆抗體特異性血小板抗原固定術（MAIPA）等，但是由于此類檢測方法操作繁瑣，設備以及成本要求高，因此無法在臨床工作中得到廣泛運用[4]。微柱凝膠免疫分析技術（MGIA）是近年來興起的新的血小板抗體檢測和交叉配型技術，目前已有相關報道顯示[5]，MGIA在新生兒同種免疫性血小板減少癥患兒血小板同種抗體檢測中獲得了良好的應用效果。本研究探討分析MGIA技術診斷新生兒免疫性血小板減少癥自身抗體的應用價值，現報告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年8月－2017年4月在我院出生診斷為血小板減少癥的新生兒172例作為研究對象，入組172例患兒均符合《實用新生兒學》中新生兒血小板減少癥相關診斷標準[5]，其外周血血小板計數均＜100×109/L。其中男97例、女75例，日齡 1d～30d，平均日齡（13.62±3.96）d，其中足月兒78例、早產兒94例。此外，選擇20例在我院臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒作為對照，其中男12例、女 8例，日齡 3d～30d，平均日齡（14.52±4.18）d。 兩組年齡在統計學上無差異。

1.2 試劑及儀器 微柱凝膠血小板抗體檢測試劑盒購于長春博迅生物技術有限責任公司；FYQ型免疫微柱孵育器購于長春博速生物技術有限公司；TD－3A型血型血清學用離心機購于長春博迅生物技術有限公司；流式細胞儀（FACScalibur）及其相關試劑均購于美國BD公司。

1.3 MGIA法檢測自身抗體 采集血小板減少患兒及自身抗體檢測陽性患兒母體3～5ml外周血，將其置于EDTA抗凝離心管內，800r/min離心10min后分離部分血漿，使用剩余血漿懸浮壓積血小板并將血小板濃度調節為（100±50）×109/L。將調節好濃度的血小板懸液貯存于塑料容器內待測將血小板抗體微柱凝膠檢測卡分別設置樣本、陰性對照、陽性對照，分別加入待測血漿、陰性對照試劑以及陽性對照試劑。參照試劑盒使用說明書，在樣本孔內加入低例子強度鹽溶液50μl、血小板懸液50μl、血小板指示紅細胞25μl；在陰性對照微孔以及陽性對照微孔加入低離子強度鹽溶液50μl、血小板廣譜裂解抗原50μl、血小板指示紅細胞25μl。將檢測卡放置于免疫微柱孵育器中37℃孵育15min，然后使用專用離心機900r/min離心2min，1500r/min離心3min[6－9]。結果判斷：紅細胞凝集塊位于凝膠表面或者凝膠中為陽性；紅細胞完全沉降于凝膠管底部為陰性。

1.4 FCM法檢測自身抗體 取血小板減少患兒（或母親）全血 3ml，加入 0.109mol/L 枸櫞酸鈉 400μl，混勻后離心15min（790r/min）；取血漿加入1ml 2%PFA 后避光固定 15min，離心 5min（5000r/min）棄去上清液，加入2ml PBS混勻后離心5min（5000r/min）棄去上清液。根據血小板計數配置抗體，血小板計數 3×109/L 加入 1μl FITC－抗人 IgG，（4～5）×109/L 加入 1.5μl FITC－抗人 IgG，（5～7）×109/L 加入2μl FITC－抗人 IgG，＞7×109/L 加入 2.5μl FITC－抗人IgG。將1支上樣管加入5μl濃血小板懸液以及10μl FITC－抗人IgG作為陽性對照，再取另外1支上樣管加入5μl濃血小板懸液作為陰性對照組。將上述準備好的血小板混液放置避光處20min，加入0.5ml PBS 后上機 （SYSMEX－K4500 血細胞分析儀）檢測。

1.6 統計學分析 采用統計學軟件SPSS 22.0進行數據處理分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MGIA對非免疫性血小板減少癥新生兒檢查情況 MGIA對20例臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒檢出結果均為陰性。

2.1 兩種方法檢測患兒血小板自身抗體 流式細胞儀法檢出血小板減少癥自身抗體患兒21例、檢出陽性率為12.21%，微柱凝膠法檢出血小板減少癥自身抗體患兒20例、檢出陽性率為11.63%，兩組檢出陽性率比較差異無統計學意義P＞0.05），見表1。

表1 兩種方法檢測患兒血小板自身抗體情況（例）

2.2 兩種方法檢測陽性患兒母親血小板自身抗體檢測陽性21例患兒母親血小板自身抗體，微柱凝膠法檢出母親血小板自身抗體19例，檢出陽性率90.48%，流式細胞儀技術檢出母親血小板自身抗體21例，檢出陽性率100.00%，兩種方法檢測陽性患兒母親血小板自身抗體檢出陽性率無顯著差異（P＞0.05），見表 2。

表2 兩種方法檢測陽性患兒母親血小板自身抗體

3 討論

引發新生兒血小板減少的原因主要包括獲得性免疫性、藥物性、感染性以及遺傳性等，其中以獲得性免疫性為主[10]。對于免疫性血小板減少癥，目前國內外均無一項特異性的實驗室檢查手段能夠對其確診。在臨床工作當中，眾多的非免疫性血小板減少癥患兒常常被臨床誤診為免疫性血小板減少癥，而基于免疫抑制劑、免疫球蛋白或糖皮質激素治療，引發患兒發生嚴重并發癥或給患兒家庭帶來了不必要的經濟損失[11]。因此對于新生兒免疫性血小板減少癥的臨床鑒別，對于指導臨床治療工作具有著重要的臨床意義。

血小板自身抗體其產生機制目前尚未明確，血小板自身抗體可引起新生兒免疫性血小板減少癥，血小板自身抗體為絕大部分的IgG以及少部分IgM，對于此類自身抗體的檢測，目前常用的方法包括FCM、SEPSA、MAIP法，雖然準確率高，但檢驗步驟繁瑣且設備要求高，而固相凝集法以及血小板免疫熒光試驗等，由于新生兒不易獲得放散所需的足夠血小板，因此檢測準確性不高[12－14]。流式細胞儀技術能夠檢測血小板相關抗體，在數秒時間內對上萬個細胞進行計算，并對細胞表面的多參數進行分析，是新生兒免疫性血小板減少癥診斷的一個重要手段，但是流式細胞儀技術設備要求高，檢測成本較大。微柱凝膠法作為一種新型的血清檢測技術，其主要工作原理為分子篩，當抗原抗體反應與凝膠分子篩相結合，檢測時游離的紅細胞能夠自由穿過凝膠柱；而當抗原抗體反應出現凝集紅細胞則由于體積過大則無法穿過凝膠柱上的分子篩，因此凝集的紅細胞則懸浮在凝膠柱上，進而能夠分別出游離紅細胞以及凝集的紅細胞[9]。此外，微柱凝膠法可在檢測時將抗人球蛋白以及血型抗體提前放入檢測孔，無需逐一加入相應的檢測物，從而簡化了檢測步驟，降低人為因素的誤差[15]。

本研究探討分析微柱凝膠免疫法診斷新生兒免疫性血小板減少癥臨床價值，并于流式細胞技術檢測結果相比較，結果顯示，對于新生兒血小板減少癥患兒自身抗體的檢測，微柱凝膠法與流式細胞技術均無顯著差異；此外，針對自身抗體檢出陽性的患兒母親進行自身抗體的檢測，結果顯示，微柱凝膠法檢出母親血小板自身抗體陽性率90.48%，流式細胞儀技術檢出母親血小板自身抗體陽性率100%，兩種方法比較，檢出陽性率無顯著差異。表明微柱凝膠免疫法與流式細胞技術檢測新生兒免疫性血小板減少癥自身抗體無明顯差異，而微柱凝膠免疫法其操作簡單，有助于新生兒免疫性血小板減少癥的臨床鑒別及早期治療方案的確定。此外，MGIA對20例臨床確診的非免疫性血小板減少癥新生兒檢出結果均為陰性。進一步提示MGIA對免疫性血小板減少癥新生兒具有較高的特異性。