p62基因沉默對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)和藥物敏感性的影響

婁歡，馬金平，武明莉，楊小風(fēng)

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000)

長(zhǎng)期的臨床隨訪研究認(rèn)為，宮頸柱狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)生率可達(dá)374～583/10萬(wàn)人左右[1]。臨床上宮頸癌患者容易早期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)期生存轉(zhuǎn)歸較差，而無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均較短[2]。不同的腫瘤相關(guān)基因或者相關(guān)蛋白，均能夠影響宮頸癌細(xì)胞的特性，導(dǎo)致癌細(xì)胞的分化、耐藥或者凋亡等病理特征的改變。P62基因是細(xì)胞自噬相關(guān)基因，P62基因的表達(dá)能夠通過(guò)影響到細(xì)胞的自噬、癌細(xì)胞有絲分裂等過(guò)程，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致癌細(xì)胞有絲分裂速度的增快。P62基因的表達(dá)能夠影響到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子的表達(dá)，進(jìn)而提高上皮細(xì)胞的核基因轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞的擴(kuò)增速度的增快[3]。部分研究者探討了P62基因在鼻咽癌患者中的表達(dá)情況，認(rèn)為P62基因的表達(dá)濃度的上升能夠?qū)е卤茄拾┘?xì)胞的浸潤(rùn)能力和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的上升[4]，部分研究者探討了P63基因與宮頸癌的關(guān)系，但多數(shù)限于流行病學(xué)研究。為了揭示P62基因的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)特征關(guān)系，從而為臨床上宮頸癌患者的臨床診療提供理論基礎(chǔ)，本次研究通過(guò)細(xì)胞基因水平的轉(zhuǎn)染沉默P62基因表達(dá)后，觀察了宮頸癌細(xì)胞的特征改變，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌Hela細(xì)胞株為本院保存，短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有效公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染 采用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化P62抑制劑質(zhì)粒及空白質(zhì)粒，測(cè)定濃度，將宮頸癌Hela細(xì)胞鋪于六孔板上，隔日更換DMEM高糖培養(yǎng)基，在細(xì)胞融合度為75%～80%時(shí)加入脂質(zhì)體和構(gòu)建的質(zhì)粒，并進(jìn)行p62－shRNA篩選，定期更換培養(yǎng)基清除死亡的細(xì)胞。檢測(cè)藥物耐藥性前對(duì)照組、空白組及慢病毒轉(zhuǎn)染組均給予 0.05mg/L、0.5mg/L 和 5mg/L 順鉑處理。

1.2.2 CCK法檢測(cè) 在 96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔），向每孔加入 10μL CCK8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入 10μL 0.1M 的 HCL溶液或者 1%w/v SDS溶液，24h內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

1.2.3 RT－PCR檢測(cè) 收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集細(xì)胞裂解液，加入 0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min，15min)，反復(fù)一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見(jiàn)一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入P62基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20pmol/ul，制備反應(yīng)體系，RT－PCR擴(kuò)增的條件與 參 數(shù) ：48℃ ，45min，94℃ ，2min；94℃ 30s，58℃60s，68℃ 2min共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7min。 ShRNA序列5’外側(cè)cttgccacaggtctccccaa 3’外側(cè) aggggtcagaggcaagcaga。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 采用annexin/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用刮匙刮取培養(yǎng)基中的細(xì)胞，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，2000r/min離心10min，去除上清液。采用預(yù)先混合的緩沖液進(jìn)行重新懸浮細(xì)胞，加入10ul的PI和10ul的annexin進(jìn)行染色，混勻后4℃放置10min，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（x±s）表示，多組間比較使用方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 p62 mRNA相對(duì)表達(dá)比較 p62－shRNA組p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組和空白shRNA 組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 各組p62 mRNA相對(duì)表達(dá)比較

2.2 各組Hela細(xì)胞增殖情況比較 p62－shRNA組培養(yǎng)24h、48h、72h細(xì)胞OD值明顯低于對(duì)照組和空白 shRNA 組（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

2.3 各組Hela細(xì)胞凋亡率比較 p62－shRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組和空白shRNA組 （P＜0.05），見(jiàn)表 3、圖 1。

2.4 順鉑處理后各組細(xì)胞存活率比較 0.05mg/L、0.5mg/L和5mg/L順鉑作用下，p62-shRNA組細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組和空白shRNA組 （P＜0.05），見(jiàn)表 4。

表2 各組Hela細(xì)胞增殖情況比較

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%）

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖

表4 順鉑處理后各組細(xì)胞存活率比較（%）

3 討論

臨床上宮頸癌的發(fā)生主要考慮與高危型HPV病毒感染導(dǎo)致的宮頸柱狀上皮細(xì)胞持續(xù)性病變有關(guān)，流行病學(xué)研究證實(shí)，在HPV16或者HPV18感染的人群中，宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可進(jìn)一步的上升[5，6]。長(zhǎng)期的臨床觀察認(rèn)為，宮頸癌患者的無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間不足34個(gè)月，綜合性治療措施治療后的3年內(nèi)病死率仍然超過(guò)了25%以上[7]。免疫靶向治療能夠在宮頸惡性腫瘤的治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其能夠通過(guò)沉默相關(guān)基因或者蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，輔助治療宮頸惡性腫瘤[8，9]。而本次研究對(duì)于宮頸癌細(xì)胞中P62基因功能的表達(dá)分析研究，能夠?yàn)榕R床上宮頸癌的免疫靶向治療提供參考靶點(diǎn)。

P62基因是調(diào)控細(xì)胞自噬和凋亡的基因，其表達(dá)的P62蛋白能夠?qū)е律掀ぜ?xì)胞多種生物學(xué)特征的改變，導(dǎo)致上皮細(xì)胞的線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙并促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂等過(guò)程。P62基因的高表達(dá)能夠?qū)е掳┘?xì)胞對(duì)于基底膜組織的突破能力的增強(qiáng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞間質(zhì)成分的分解，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[2]。基礎(chǔ)領(lǐng)域相關(guān)的臨床研究認(rèn)為，P62基因的表達(dá)能夠?qū)е履[瘤干細(xì)胞活性的增強(qiáng)，提高腫瘤干細(xì)胞自我增殖能力，加劇了癌細(xì)胞的持續(xù)性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)[10]。

本次研究中通過(guò)對(duì)于P62基因進(jìn)行沉默，可以發(fā)現(xiàn)沉默表達(dá)P62基因組的細(xì)胞株中P62基因表達(dá)水平明顯的下降，提示了轉(zhuǎn)染的成功。對(duì)于不同組別宮頸癌細(xì)胞株的生物學(xué)特征的分析可見(jiàn)，沉默表達(dá)P62基因的癌細(xì)胞，其增殖活性明顯的下降，提示了P62基因?qū)τ诰S持宮頸癌細(xì)胞株的增殖特性具有重要的作用，通過(guò)匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn)，筆者認(rèn)為P62基因?qū)τ趯m頸癌細(xì)胞株增殖特性的維持作用，主要考慮與P62基因的下列幾個(gè)作用有關(guān)[11，12]：⑴P62基因能夠提高宮頸癌細(xì)胞核DNA上游啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性的增加；⑵P62基因能夠通過(guò)激活宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的MAPK或者NOTCH信號(hào)通路，進(jìn)而提高了宮頸癌細(xì)胞的增殖速度。梁冠男等[13]研究者也認(rèn)為，在過(guò)度表達(dá)P62基因的宮頸癌中，癌細(xì)胞的浸潤(rùn)能力明顯的增強(qiáng)，同時(shí)癌細(xì)胞的增殖速度明顯加快，高于P62基因低表達(dá)的宮頸癌患者。在探討P62基因?qū)τ趯m頸癌細(xì)胞凋亡特性的影響過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)，P62基因沉默表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的凋亡速度明顯增加，高于P62未沉默表達(dá)組，差異較為明顯，提示了P62基因?qū)τ趯m頸癌細(xì)胞的凋亡具有顯著的抑制作用，P62基因?qū)τ诎┘?xì)胞凋亡的影響，主要通過(guò)對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的影響，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激水平的改變，提高了線粒體的ATP合成活性，進(jìn)而提高了癌細(xì)胞的增殖水平，抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。但部分研究者并不認(rèn)為P62基因的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的凋亡有關(guān)，認(rèn)為P62基因負(fù)載后，宮頸癌細(xì)胞的凋亡比例并無(wú)明顯的下降[15]，這主要考慮與不同宮頸癌細(xì)胞株的選擇或者P62基因的負(fù)載程度的差異有關(guān)。最后本次研究通過(guò)不同濃度的順鉑進(jìn)行癌細(xì)胞的耐藥性檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)順鉑處理后的各組細(xì)胞均存在明顯的凋亡現(xiàn)象，但P62基因沉默組患者的細(xì)胞存活率較低，提示P62基因?qū)τ诰S持癌細(xì)胞的存活狀態(tài)，提高癌細(xì)胞的存活能力具有重要的作用。

本次研究的創(chuàng)新性在于探討了P62基因沉默表達(dá)后的宮頸癌細(xì)胞株的生物學(xué)特征的改變。綜上所述，p62基因沉默可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加對(duì)順鉑的敏感性。