反義寡核苷酸處理伊馬替尼耐藥慢粒細胞后Bcl-x剪接異構體的變化

張靜，李書琪，黃波，閔清華，姜鈺環，楊偉明，徐顏美，林晉，劉靜，王小中

(江西省檢驗醫學重點實驗室，南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西 南昌330006)

伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥是慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）治療失敗的主要原因之一，其耐藥機制十分復雜。眾多研究報道，基因異常剪接是腫瘤出現化療抵抗的重要分子基礎[1-3]。Bcl-x基因是Bcl-2家族成員之一，其pre-mRNA通過選擇性剪接（alternative splicing）主要生成兩種剪接異構體，Bcl-xL和Bcl-xS。Bcl-xL是重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-xS則是重要的促凋亡蛋白，兩者生物功能相互拮抗，表達處于平衡狀態[4]。當Bcl-x基因的剪接發生異常時，Bcl-xL/BclxS比值顯著升高，現已證實這是乳腺癌等[5，6]腫瘤發生、發展的關鍵分子事件。所謂vMO技術是近年發展起來的一種能實現體內、外直接調控靶基因選擇性剪接的高效方法，與培養的細胞共同孵育能高效轉運至胞內，也可以經靜脈、腹腔注射到體內后能高效轉運至全身各組織器官，與靶基因前mRNA的特定核苷酸序列結合，從而調控選擇性剪接。2016年Nature雜志報道應用Vivo-Morpholinos（vMO）在小鼠體內靶向調控內含子剪接位點，為我們提供了成功調控選擇性剪接的例證[7]。目前，運用vMO技術處理IM耐藥CML細胞后，觀察Bclx剪接異構體變化的研究尚未見相關報道，本研究有望為臨床治療CML及其他伴Bcl-x剪接異常的腫瘤的化療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 IM耐藥CML細胞K562/G01（購自中國醫學科學院天津血液研究所）。RMPI 1640培養基（Bioind）含10%FBS，青霉素和鏈霉素濃度均為100U/ml。Imatinib購自Sigma Aldrich公司，PrimeScriptTM RT Master Mix逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技術有限公司），Bcl－x抗體 （美國BD公司），β－actin抗體 （Proteintech中國分公司），vMO試劑盒（美國Gene Tools公司）

1.2 方法

1.2.1 vMO序列設計原理 我們檢索相關文獻發現，腫瘤細胞中調控Bcl－x基因外顯子2b剪接的機制均為剪接增強調控，在Bcl－x基因的外顯子2a、2b及內含子2中均存在相應的外顯子增強子，使外顯子2b的剪接得以增強，即促進Bcl－xL的形成，減少Bcl－xS的形成。反義寡核苷酸能通過與pre－mRNA上5’或3’剪接位點靶向結合從而阻止剪接體對該位點的識別，進而增加其他隱蔽剪接位點的使用，最終實現對基因的剪接調控。我們設計本項目的序列由Gene Tools公司合成。

1.2.2 總 RNA 提取及 Bcl－xL 和 Bcl－xS mRNA 表達水平檢測 根據Bcl－x、GAPDH基因設計特異引物，引物序列見表1。

按照以下PCR擴增反應體系 2×Taq PCR Master Mix 10μl， 上下游引物各 1μl，cDNA 2μl及dH2O 6μl，總反應體積為20μl進行加樣，點動混勻，離心后放入PCR擴增儀進行擴增，反應條件為：95℃ 5min；（95℃ 30s； 退火溫度 （見表）35s；72℃ 30s）35 個循環；72℃延伸 5min；以 GAPDH 作為內參。反應結束后，取PCR產物10μl，進行2%瓊脂糖凝膠電泳。利用BIO－RAO凝膠成像儀進行圖像檢測，并用其分析軟件（Image Lab）進行定量分析。

1.2.3 Western－Blot檢測 Bcl－xL 和 Bcl－xS 蛋白表達水平 細胞總蛋白提取和定量檢測合格后，經SDS－PAGE電泳。孵育一抗：用一抗稀釋液對一抗體進行稀釋 （Bcl－x 稀釋：1：4000； 內參稀釋：1：1000），孵育二抗：用1×TBST或者封閉液稀釋二抗（anti－rabbit：1：10000）， 將 PVDF 膜完全浸沒于二抗液中，洗膜后暗室曝光拍照存圖，利用BIO－RAO凝膠成像儀進行圖像檢測，并用其分析軟件（Image Lab）進行定量分析，實驗重復三次。

1.3 統計學方法 運用SPSS 23.0對實驗數據進行統計學分析，正態計量數據以均數±標準差（x±s）形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組采用方差分析，P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 K562/G01細胞對Imatinib化療耐受作用 取對數生長期的K562/G01細胞A、B、C，調整每孔細胞密度均（2～3）×105，依次向每孔加 2μM imatinib（根據天津血液研究所建議耐藥細胞穩定生存用量）作用0，24h，48h，鏡下觀察到細胞形態幾乎無變化，提示K562/G01細胞對imatinib出現抵抗（圖1）。

圖 1 K562/G01細胞對 imatinib抵抗 (A，B，C：K562/G01細胞2μM imatinib 作用 0，24，48h)

2.2 合成靶向Bcl－x剪接調控位點的特異性vMO我們設計的靶向調控Bcl－x選擇性剪接的vMO序列如下：5′－GCTTGGTTCTTACCCAGCCGCCGTT－3′（下劃線處為外顯子2b和內含子2交界處），對應Bcl－x 基因序列為：5′－CAGGAG[AACGGCGGCTGG gta aga acc aag c]cc ctt gtg tgt c－3′（大寫字母表示外顯子序列，小寫字母表示內含子序列，中括號內為互補結合區）。

2.3 vMO能穩定高效轉染K562/G01細胞 如前文所述，我們初步設計合成了靶向調控Bcl－x選擇性剪接的vMO序列，將3′端以熒光素FAM標記，于飽和濕度條件下37℃，5%CO2，10%小牛血清，RPMI 1640培養基與耐藥CML細胞株K562/G01共孵育 24h，48h，72h，96h，使用 imatinib 濃度1μM，取細胞以PBS洗至無游離熒光于倒置顯微鏡觀察，流式細胞儀檢測胞內熒光強度，得出陽性百分率。結果顯示48h大量細胞發熒光（圖2.A），同時流式細胞術檢測vMO轉染K562/G01細胞陽性率達77.74%（圖2.B），說明vMO在48h后能成功高效的轉染目的細胞。

表1 PCR反應引物序列

圖2 倒置熒光顯微鏡觀察熒光標記vMO在48h轉染K562/G01細胞（A），流式細胞儀檢測48h胞內熒光強度（B）

2.4 vMO有效調節Bcl-xL/Bcl-xS mRNA比值 按照上述條件同時提取4個不同處理組細胞的RNA，經過逆轉錄、PCR擴增和瓊脂糖電泳，最終在紫外燈下觀察條帶結果。PCR瓊脂糖電泳條帶顯示：與單獨IM和單獨vMO組處理K562/G01細胞相比，IM+vMO組的Bcl-xL mRNA表達量顯著降低，同時Bcl-xS mRNA表達量明顯升高。Bcl-xL和Bcl-xS mRNA進行灰度值半定量分析，則BclxL/Bcl-xS比值下降更明顯。見圖3。

圖3 vMO處理前后細胞胞內Bcl-xL和Bcl-xS mRNA比值的表達變化

2.5 vMO有效調節Bcl-xL/Bcl-xS蛋白比值 以相同的條件提取4個實驗組細胞的總蛋白，按照上述相同條件提取4個不同處理組細胞的總蛋白，通過相關軟件分析，經過蛋白電泳、轉膜、孵抗體和曝光后，最終得到蛋白條帶結果。Bcl-xL在vMO聯合IM處理之后表達量明顯降低，同時Bcl-xS表達量明顯升高。說明，IM聯合vMO轉染K562/G01細胞影響Bcl-xL/Bcl-xS比值。見圖4。

3 討論

圖4 Western blot檢測不同處理組對Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表達的影響

人類凋亡相關基因Bcl-x會通過選擇性剪接產生Bcl-xL和Bcl-xS兩種異構體，它們在維持細胞生存上分別起抑制或促進凋亡的作用。近年發現異常選擇性剪接在多種不同類型白血病患者體內普遍存在，與白血病的發生、發展及化療抵抗等密切相關[8]。研究報道，剪接體Bcl-xL在CML中高表達，其作用不是引發CML或維持CML狀態，而是促進CML向加速期或急變期發展，并且可以提高CML細胞對TKIs等化療藥物的抗性[9]。另有研究證實，高濃度的Bcl-xL是維持CML干細胞生長的重要因素之一，而CML干細胞的增殖、衍變則是CML進展的根本和耐藥的源泉[10]。本研究結果發現，Bcl-xL在IM耐藥CML中高表達，而Bcl-xS顯著低表達，提示Bcl-x基因異常選擇性剪接是導致CML進展和化療抵抗的關鍵分子基礎，與文獻報道一致。綜合分析其機制主要涉及兩個方面：一方面，Bcl-xL抗凋亡剪接體的過量表達能抑制化療藥物誘導的死亡受體和(或)線粒體凋亡通路的激活；另一方面，Bcl-xS促凋亡剪接體的表達水平和活性的降低，則能致正常濃度的化療藥物不能誘導凋亡信號的傳播[11，12]。

vMO技術是一種能體內外直接調控靶基因選擇性剪接的新方法。本研究在對CML的研究基礎上，以耐藥CML（K562/G01）細胞為模型，利用特殊設計的vMO技術與K562/G01細胞進行共培養，結果顯示單獨IM組和單獨vMO租對K562/G01細胞Bcl-x基因選擇性剪接模式的調控是有限的，產生此研究結果的可能原因是與耐藥細胞中存在維持Bcl-x發生異常剪接的機制有關。IM藥物作用的發揮在很大程度上是通過對細胞凋亡的誘導實現的，而在藥物選擇壓力條件下，細胞可能通過抑制凋亡通路實現對IM耐受作用。因此，我們推測IM聯合vMO在K562/G01中能有效糾正Bcl-x基因的剪接模式，這一變化可能與兩者明顯協同作用有關，進而激活凋亡相關信號通路，誘導耐藥CML細胞凋亡，仍需后續實驗進一步探討。其調控機制是：當反義寡核苷酸靶向與Bcl-x基因外顯子2b和內含子2交界處結合后，該5’剪接位點不能被剪接體識別，將迫使剪接體與外顯子2a處5’剪接位點結合，最終導致外顯子2b被切除，在減少Bcl-xL的生成的同時增加BclxS的生成，顯著降低Bcl-xL/Bcl-xS比值，實現雙向調控，這才是靶向Bcl-x基因治療的最優策略。