miRNA-375通過MYC/EMT對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲和遷移影響

[摘要]"目的"探究miRNA-375（miR-375）通過MYC/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）侵襲和遷移的影響。

方法"將未做任何處理的NSCLC細(xì)胞A549作為空白組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒的A549細(xì)胞作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒的A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-375在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)量，以及miR-375在正常肺組織細(xì)胞（BEAS-2B細(xì)胞）和A549細(xì)胞中的表達(dá)量;通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞的侵襲、遷移能力;采用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中MYC蛋白和EMT相關(guān)蛋白（E-鈣黏蛋白、波形蛋白）的表達(dá)量。

結(jié)果"miR-375在NSCLC組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織（t=16.88，P<0.05），在A549細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于BEAS-2B細(xì)胞（t=8.51，P<0.05）。過表達(dá)miR-375后，實(shí)驗(yàn)組與空白組和對(duì)照組相比，NSCLC細(xì)胞的侵襲（F=29.55，P<0.05）、遷移（F=90.21，P<0.05）能力增強(qiáng)，MYC蛋白表達(dá)增加（F=37.15，P<0.05），E-鈣黏蛋白表達(dá)減少（F=47.25，P<0.05），波形蛋白表達(dá)增加（F=77.64，P<0.05）。

結(jié)論"上調(diào)miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC的侵襲和遷移能力。

[關(guān)鍵詞]"微RNAs;癌，非小細(xì)胞肺;基因，myc;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

[中圖分類號(hào)]"R734.2;R342.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]"A

[文章編號(hào)]""2096-5532（2019）06-0639-05

doi：10.11712/jms201906003

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

MIRNA-375 AFFECTS THE INVASION AND MIGRATION OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER CELLS VIA MYC/EPITHE-

LIAL-MESENCHYMAL TRANSITION

MENG Haining， GAO Tian， WU Junyu， HUANG Qiao， XU Shengwei， SHEN Ruowu

（Department of Special Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of miRNA-375 （miR-375） on the invasion and migration of non-small cell lung cancer （NSCLC） via MYC/epithelial-mesenchymal transition （EMT）.

Methods NSCLC A549 cells without any treatment were established as blank group， A549 cells transfected with empty vector lentivirus were established as control group， and A549 cells transfected with miR-375 lentiviral vector were established as experimental group. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression of miR-375 in NSCLC tissue and adjacent tissue， as well as in BEAS-2B cells and A549 cells. Transwell assay was used to measure the invasion and migration abilities of A549 cells， and Western blot was used to measure the expression of MYC protein and EMT-related proteins （E-cadherin and vimentin） in the three groups of cells.

Results The NSCLC tissue had significantly higher expression of miR-375 than the adjacent tissue （t=16.88，Plt;0.05）， and A549 cells had significantly higher expression of miR-375 than BEAS-2B cells （t=8.51，Plt;0.05）. After the overexpression of miR-375， compared with the blank group and the control group， the experimental group had significant increases in the abilities of invasion （F=29.55，Plt;0.05） and migration （F=90.21，Plt;0.05）， a significant increase in the protein expression of MYC （F=37.15，Plt;0.05）， a significant reduction in the expression of E-cadherin （F=47.25，Plt;0.05）， and a significant increase in the expression of vimentin （F=77.64，Plt;0.05）.

Conclusion Upregulation of miR-375 can promote the invasion and migration of NSCLC through MYC/EMT.

[KEY WORDS] microRNAs; carcinoma， non-small-cell lung; genes， myc; epithelial-mesenchymal transition; cell movement

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)也是全球惡性腫瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治療方法是手術(shù)、放療和化療，盡管放療和化療的應(yīng)用使NSCLC預(yù)后得到很大改善，但其生存率還是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究顯得尤為重要。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)肺癌的進(jìn)展、診斷以及治療起著關(guān)鍵作用，其在肺癌的治療研究中備受關(guān)注[5]。miRNA是一類長(zhǎng)約20個(gè)氨基酸的小RNA，它可以與特定的靶點(diǎn)結(jié)合，影響靶位點(diǎn)的mRNA翻譯，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的表達(dá)[6]。有研究表明，miRNA-375（miR-375）與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡有著密切的聯(lián)系，而且miR-375的表達(dá)與癌癥病人的總生存率相關(guān)，所以推測(cè)miR-375可能是一種有用的臨床預(yù)后生物標(biāo)志物[7-8]。JUNG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MYC可以受miR-375的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，對(duì)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些藥物可以通過抑制MYC通路的激活來抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12];hsa-miR-24則可以通過調(diào)節(jié)c-MYC/EMT軸來抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[13];MYC還可以通過抑制RPS19/EMT信號(hào)傳導(dǎo)的激活來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。本研究旨在探討miR-375是否可通過MYC/EMT對(duì)NSCLC的侵襲和遷移產(chǎn)生影響。

1"材料與方法

1.1"細(xì)胞與樣本

所用NSCLC細(xì)胞（A549）和正常肺組織細(xì)胞（BEAS-2B）由青島大學(xué)博雅樓實(shí)驗(yàn)室凍存。A549細(xì)胞用RPMI-1640（HyClone，美國）培養(yǎng)液培養(yǎng)，BEAS-2B細(xì)胞用LHC-9（HyClone，美國）培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)兩種培養(yǎng)液都加入體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（索萊寶，北京）。含EDTA的胰蛋白酶（索萊寶，北京）用于消化貼壁細(xì)胞。NSCLC組織和癌旁組織的新鮮樣本各30例，來自青島市市立醫(yī)院。本研究的組織來源病人均簽署了書面同意書，研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2"細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將A549細(xì)胞接種于96孔板中，每孔10 000個(gè)，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)共分3組，在96孔板中未做任何處理的A549細(xì)胞作為空白組，將轉(zhuǎn)染含空載體慢病毒（吉?jiǎng)P基因公司，上海）的A549細(xì)胞作為對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒（吉?jiǎng)P基因公司，上海）的A549細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。將3組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，移除96孔板中的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，每孔100 μL。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞中miR-375的表達(dá)量。

1.3"qRT-PCR

收集長(zhǎng)勢(shì)良好的細(xì)胞，按照iso plus RNA提取試劑盒（Takara，日本）的說明書提取3組細(xì)胞的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，日本）將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A（Takara，日本）進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)細(xì)胞中miR-375的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán);60 ℃、15 s。實(shí)驗(yàn)所用引物均購自上海生工，其中U6作為miRNA-375的內(nèi)源性參照。引物序列見表1。

1.4"Transwell小室實(shí)驗(yàn)

①遷移實(shí)驗(yàn)：向24孔板（康寧，美國）的3個(gè)孔中加入含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)液，每孔500 μL，將3個(gè)Transwell小室（康寧，美國）分別放入3個(gè)孔中。取3組細(xì)胞各5×104個(gè)分別接種于以上3個(gè)Transwell小室內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽擦拭3個(gè)Transwell小室的內(nèi)膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。②侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠（康寧，美國）與完全培養(yǎng)液按1∶9的比例稀釋，將稀釋后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中4 h，其余實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5"Western blot檢測(cè)

取3組細(xì)胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下分別放入3個(gè)離心管中，以5 000 r/min離心5 min。去上清留細(xì)胞沉淀，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，上清即為總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)加入上樣緩沖液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝膠中電泳，電泳結(jié)束后將膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（Millipore，美國）。用脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下與MYC（1∶1 000，CST）、β-actin（1∶3 000，Bioss）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin，1∶1 000，CST）、波形蛋白（Vimentin，1∶1 000，CST）的一抗一起孵育過夜;加入二抗（1∶1 000，Abcam）低速振蕩60 min。用超敏型化學(xué)發(fā)光底物試劑（ECL）進(jìn)行蛋白條帶成像，分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6"統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以±s形式表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有顯著性。

2"結(jié)"果

2.1"miR-375的表達(dá)

2.1.1"NSCLC組織和癌旁組織miR-375表達(dá)的比較"癌旁組織和NSCLC組織miR-375的相對(duì)表達(dá)量分別為0.40±0.20和1.00±0.03，NSCLC組織miR-375的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有顯著性（t=16.88，P<0.05）。

2.1.2"BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞miR-375表達(dá)的比較"BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞miR-375的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.02和2.20±0.30，A549細(xì)胞miR-375的表達(dá)明顯高于BEAS-2B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.51，P<0.05）。

2.1.3"各組細(xì)胞miR-375表達(dá)的比較"實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞miR-375的表達(dá)較空白組和對(duì)照組明顯增加，差異有顯著性（F=1 677.95，P<0.05），而空白組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2"miR-375對(duì)細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

與空白組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移、侵襲能力均增強(qiáng)，差異有顯著意義（F=90.21、29.55，P<0.05），而空白組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.3"miR-375對(duì)MYC蛋白表達(dá)的影響

與空白組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MYC的表達(dá)增加，差異有顯著意義（F=37.15，P<0.05），而空白組和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4"miR-375對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞E-cadhe-

rin的表達(dá)降低，Vimentin的表達(dá)升高，差異均有顯著性（F=47.25、77.64，P<0.05），而空白組和對(duì)照組E-cadherin和Vimentin的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1和表3。

3"討"論

肺癌是全球范圍內(nèi)很常見的一種腫瘤，NSCLC在所有肺癌類型中發(fā)病率最高[15]。NSCLC確診時(shí)多數(shù)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，這是其死亡率高的主要原因，所以研究影響NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)顯得尤為重要。miRNAs是小分子內(nèi)源性非編碼RNA，可以影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而起到腫瘤抑制基因或致癌基因的作用[16-17]。已有大量的證據(jù)表明，miRNAs對(duì)NSCLC的進(jìn)展有影響[18-19]。在眾多的miRNAs中，越來越多的研究集中在miR-375上，miR-375與癌癥總體生存率顯著相關(guān)，并且對(duì)多種癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)和分化產(chǎn)生作用[8，20]。但miR-375在NSCLC中的研究較少，它對(duì)NSCLC的影響還不甚明確，所以本研究選擇了miR-375作為NSCLC的研究靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，miR-375在NSCLC組織中呈高表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[21]，推測(cè)miR-375在NSCLC中起促癌基因的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-375后細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)，表明miR-375可以調(diào)節(jié)NSCLC的侵襲遷移能力，并且是起促癌基因的作用。但是也有研究結(jié)果顯示，miR-375在肺癌、食管癌、肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)[22-24]。目前miR-375在癌癥中具體的作用還不確定，其是否能作為癌癥治療的靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步證實(shí)。目前，綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)可以看出，miR-375既可以為癌基因，也可以為抑癌基因，

它在不同腫瘤中的作用不同。MYC癌蛋白為“超級(jí)轉(zhuǎn)錄因子”，可以調(diào)控基因組15%左右的轉(zhuǎn)錄，其下游效應(yīng)子可以參與核糖體生物合成、蛋白質(zhì)翻譯、協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖和分化等生物功能[25-26]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-375后NSCLC細(xì)胞MYC蛋白的表達(dá)水平升高，表明miR-375可以通過調(diào)節(jié)MYC的表達(dá)來影響NSCLC的侵襲和遷移。EMT是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，在該過程中穩(wěn)定的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的、具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，故EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著不可或缺的角色[27-28]。MYC也可以通過調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生發(fā)展來影響腫瘤進(jìn)展[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著miR-375的過表達(dá)，NSCLC細(xì)胞的MYC表達(dá)顯著增加，侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生明顯變化，提示miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

[參考文獻(xiàn)]

[1]SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2017[J]."CA-A Cancer Journal for Clinicians， 2017，67（1）：7-30.

[2]FELIP E， GARRIDO P， TRIGO J M， et al. SEOM guidelines for the management of non-small-cell lung cancer （NSCLC）[J]."Clinical amp; Translational Oncology， 2009，11（5）：284-289.

[3]OU S H， ZELL J A， ZIOGAS A A， et al. Prognostic factors for survival of stage I nonsmall cell lung cancer patients： a po-

pulation-based analysis of 19，702 stage Ⅰ patients in the California cancer registry from 1989 to 2003[J]."Cancer， 2007，110（7）：1532-1541.

[4]HEIST R S， ENGELMAN J A. SnapShot：non-small cell lung cancer[J]."Cancer Cell， 2012，21（3）：448 e2.

[5]MOHAMMAD A I， SHWETA A， GOPINATH P， et al. MicroRNA in lung cancer：role， mechanisms， pathways and the-

rapeutic relevance[J]."Molecular Aspects of Medicine， 2018. doi：10.1016/j.mam.2018.07.003.

[6]WANG Jin， CHEN Jinyun， SEN S. MicroRNA as biomarkers and diagnostics[J]."Journal of Cellular Physiology， 2016，231（1）：25-30.

[7]ARVIDSSON Y， REHAMMAR A， BERGSTROM A A， et al. miRNA profiling of small intestinal neuroendocrine tumors defines novel molecular subtypes and identifies miR-375 as a biomarker of patient survival[J]."Modern Pathology， 2018，31（8）：1302-1317.

[8]SHAO Yingjie， GENG Yiting， GU Wendong， et al. Prognostic significance of microRNA-375 downregulation in solid tumors：a meta-analysis[J]."Disease Markers， 2014， 2014：626185.

[9]JUNG H M， PATEL R S， PHILLIPS B L， et al. Tumor suppressor miR-375 regulates MYC expression via repression of CIP2A coding sequence through multiple miRNA-mRNA interactions[J]."Molecular Biology of the Cell， 2013，24（11）：1638-1648，S1-7.

[10]CONACCI-SORRELL M， MCFERRIN L， EISENMAN R N. An overview of MYC and its interactome[J]."Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine， 2014，4（1）： a014357.

[11]HE Lin， THOMSON J M， HEMANN M T， et al. A micro-

RNA polycistron as a potential human oncogene[J]."Nature， 2005，435（743）：828-833.

[12]CHEN Yali， HAN Ling， BAI Liping， et al. Trichosanthin inhibits the proliferation of cervical cancer cells and downregulates STAT-5/C-myc signaling pathway[J]."Pathology Research and Practice， 2019，215（4）：632-638.

[13]SU B J， XU T， BRUCE J P， et al. hsa-miR-24 suppresses metastasis in nasopharyngeal carcinoma by regulating the c-Myc/epithelial-mesenchymal transition axis[J]."Oncology Reports， 2018，40（5）：2536-2546.

[14]CHEN K C， HSU W H， HO J Y， et al. Flavonoids luteolin and quercetin inhibit RPS19 and contributes to metastasis of cancer cells through c-Myc reduction[J]."Journal of Food and Drug Analysis， 2018，26（3）：1180-1191.

[15]FADEJEVA I， OLSCHEWSKI H， HRZENJAK A. Micro-

RNAs as regulators of cisplatin-resistance in non-small cell lung carcinomas[J]."Oncotarget， 2017，8（70）：115754-115773.

[16]CHEN C Z. MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors[J]."The New England Journal of Medicine， 2005，353（17）：1768-1771.

[17]CEPPI P， MUDDULURU G， KUMARSWAMY R， et al. Loss of miR-200c expression induces an aggressive， invasive， and chemoresistant phenotype in non-small cell lung cancer[J]."Molecular Cancer Research：MCR， 2010，8（9）：1207-1216.

[18]MORETTI F， D’ANTONA P， FINARDI E， et al. Systema-

tic review and critique of circulating miRNAs as biomarkers of stage Ⅰ-Ⅱ non-small cell lung cancer[J]."Oncotarget， 2017，8（55）：94980-94996.

[19]ZHOU Qun， HUANG Shaoxin， ZHANG Feng， et al. MicroRNAs：a novel potential biomarker for diagnosis and therapy in patients with non-small cell lung cancer[J]."Cell Prolife-

ration， 2017，50（6）：e12394.

[20]LIU X H， WANG J， DONG Y H. The inhibitory effect of miR-375 targeting sp1 in colorectal cancer cell proliferation[J]."European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2018，22（2）：405-411.

[21]GAN Tingqing， CHEN Wenjie， QIN Hui， et al. Clinical value and prospective pathway signaling of microRNA-375 in lung adenocarcinoma：a study based on the cancer genome atlas （TCGA）， gene expression omnibus （GEO） and bioinformatics analysis[J]."Medical Science Monitor， 2017，23：2453-2464.

[22]CHEN Wenjie， GAN Tingqing， QIN Hui， et al. Implication of downregulation and prospective pathway signaling of microRNA-375 in lung squamous cellcarcinoma[J]."Pathology Research and Practice， 2017，213（4）：364-372.

[23]HE X X， CHANG Y， MENG F Y， et al. MicroRNA-375 targets AEG-1 in hepatocellular carcinoma and suppresses liver cancer cell growth in vitro and in vivo[J]."Oncogene， 2012，31（28）：3357-3369.

[24]DING Ling， XU Yanjun， ZHANG Wei， et al. MiR-375 frequently downregulated in gastric cancer inhibits cell proliferation by targeting JAK2[J]."Cell Research， 2010，20（7）：784-793.

[25]MEYER N， PENN L Z. Reflecting on 25 years with MYC[J]."Nature Reviews Cancer， 2008，8（12）：976-990.

[26]DANG C V， O’DONNELL K A， ZELLER K I， et al. The c-Myc target gene network[J]."Seminars in Cancer Biology， 2006，16（4）：253-264.

[27]PUISIEUX A， BRABLETZ T， CARAMEL J. Oncogenic roles of EMT-inducing transcription factors[J]."Nature Cell Biology， 2014，16（6）：488-494.

[28]NIETO M A， HUANG R Y， JACKSON R A， et al. EMT：2016[J]."Cell， 2016，166（1）：21-45.

[29]LI Huaifeng， JIN Yunpeng， HU Yunping， et al. The PLGF/c-MYC/miR-19a axis promotes metastasis and stemness in gallbladder cancer[J]."Cancer Science， 2018，109（5）：1532-1544.