shRNA干擾URG11表達對骨肉瘤細胞惡性表型影響

[摘要]"目的"研究上調基因11（URG11）對骨肉瘤細胞（MG63）惡性表型的影響。

方法"用URG11短發夾RNA（shRNA）重組慢病毒感染細胞，以實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測干擾效果。四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）測定細胞增殖，流式細胞術測定細胞凋亡，Transwell檢測細胞侵襲和遷移，Western blot檢測裂解的半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）和波形蛋白（Vimentin）等表達。

結果"URG11 shRNA重組慢病毒感染MG63細胞后，URG11表達下降，差異有顯著性（F=181.200、97.307，Plt;0.001）;細胞存活率、侵襲和遷移數量降低，細胞凋亡率升高，E-cadherin、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，Vimentin、MMP-9和MMP-2蛋白表達水平降低，差異均有顯著性（F=28.064～625.516，Plt;0.05）。

結論"shRNA干擾URG11表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化，并誘導細胞凋亡。

[關鍵詞]"骨肉瘤;上調基因11;腫瘤侵潤;細胞運動;細胞凋亡

[中圖分類號]"R738.1

[文獻標志碼]"A

[文章編號]""2096-5532（2019）06-0634-05

doi：10.11712/jms201906002

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

EFFECT OF SHRNA INTERFERENCE WITH EXPRESSION OF URG11 ON MALIGNANT PHENOTYPE OF OSTEOSARCOMA CELLS

MENG Tao， LI Yuxia， LI Weihua， PAN Huagang， ZHANG Song， WANG Xiao

（Department of Orthopaedics， Huaihe Hospital， He′nan University， Kaifeng 475001， China）

[ABSTRACT] Objective To study the effect of up-regulated gene 11 （URG11） on the malignant phenotype of osteosarcoma cells （MG63）.

Methods The cells were infected with URG11 short hairpin RNA （shRNA） recombinant lentivirus， and the interference effect was determined by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and Western blot. Cell proliferation was determined by MTT assay， cell apoptosis was determined by flow cytometry， and cell invasion and migration were determined by Transwell assay. Western blot was used to determine the expression of cleaved caspase-9， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2）， E-cadherin， cleaved caspase-3， matrix metalloproteinase 9 （MMP-9）， and Vimentin.

Results After MG63 cell infection with URG11 shRNA recombinant lentivirus， URG11 expression was significantly reduced （F=181.200 and 97.307，Plt;0.001）. There were significant decreases in cell survival rate， number of cells with invasion and migration， and expression levels of Vimentin， MMP-9， and MMP-2 proteins， but there were significant increases in cell apoptosis rate and expression levels of E-cadherin， cleaved caspase-9， and cleaved caspase-3 proteins （F=28.064-625.516，Plt;0.05）.

Conclusion shRNA interference with URG11 expression can inhibit the proliferation， invasion， migration， and epithelial-mesenchymal transition of osteosarcoma cells and induce cell apoptosis.

[KEY WORDS] osteosarcoma; up-regulated gene 11; neoplasm invasiveness; cell movement; apoptosis

骨肉瘤是一種好發于青壯年和青少年的惡性骨腫瘤[1]，其惡性表型如增殖、凋亡、侵襲等與細胞內異常表達基因有關[2]。上調基因11（URG11）是近年來發現的參與細胞運動、增殖等過程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中發揮癌基因作用，下調URG11腫瘤生長和轉移能力減弱[4-5]。URG11在骨肉瘤組織中呈陽性表達，且與腫瘤病人分期、轉移相關，但其在骨肉瘤細胞中的作用尚不明確[6]。本實驗通過干擾URG11的表達，探討URG11對骨肉瘤細胞惡性表型的影響，為靶向URG11治療骨肉瘤提供依據。

1"材料與方法

1.1"細胞和試劑

骨肉瘤細胞MG63購自上海研謹生物科技有限公司;polybrene購自美國Sigma公司;SYBR定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;陰性對照慢病毒和URG11短發夾RNA（shRNA）重組慢病毒由吉滿生物科技（上海）有限公司構建;基質金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體、URG11抗體購自美國Abcam;裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗體、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、

裂解的半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。

1.2"慢病毒感染

骨肉瘤細胞以每孔5×104個接種6孔板，于培養箱內培養，細胞融合度為40%時，以MOI=20分別添加慢病毒，再加入適量的polybrene（終濃度為5 mg/L）;培養12 h以后，加入新鮮培養液;培養72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，以1 mg/L的嘌呤霉素篩選穩定轉染的細胞系。把不感染慢病毒的細胞設置為Control組（A組），把感染陰性對照慢病毒以及URG11 shRNA重組慢病毒的細胞分別設置為shRNA-NC（B組）、URG11 shRNA（C組）。

1.3"實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定干擾效果

A、B、C組細胞提取總RNA，反轉錄成cDNA后進行qRT-PCR。所用引物種類及其序列見表1。用SYBR定量PCR試劑盒分析URG11表達變化，計算方法為2-△△CT法，內參為β-actin。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.4"蛋白免疫印跡（Western blot）測定干擾效果

A、B、C組細胞分別用PBS洗滌2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法測定蛋白樣品濃度，每孔30 μg蛋白樣品，設置120 V的電壓電泳2 h后，從玻璃板中間取出凝膠。將PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后進行轉膜，轉膜置于4 ℃條件進行。將PVDF膜置于新配置的含體積分數0.05牛血清蛋白溶液中，在室溫結合2 h。把URG11一抗按1∶800倍稀釋，PVDF膜置于一抗反應液中孵育過夜。再將二抗按1∶2 000倍稀釋后，把PVDF膜置于二抗反應液內孵育2 h。使用ECL發光。采用Image J分析內參β-actin和目的條帶URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.5"四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測細胞增殖

A、B、C組細胞培養24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL細胞培養液至每個孔內培養4 h，再加入150 μL的二甲基亞砜，混合反應后，經空白孔調零。以酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度（A）值，把Control細胞的存活率設置為100%，分析其他各組細胞存活率變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.6"流式細胞術檢測細胞凋亡

A、B、C組細胞中分別添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式細胞儀中檢測細胞凋亡變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.7"Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移

A、B、C組細胞以不含血清的培養液懸浮，細胞密度調整為7×107/L，分別添加到Transwell小室的上室內進行遷移實驗。每組添加200 μL細胞懸液，下室內添加500 μL的含血清培養液。24 h后，將小室取出，把沒有穿膜的細胞擦掉并以PBS洗滌后，分別添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光鏡下選取5個視野，計數細胞遷移數目。在侵襲實驗前以基質膠將Transwell小室濕化，其余步驟同遷移實驗。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.8"Western blot檢測細胞中相關蛋白表達變化

A、B、C組細胞按照1.4中Western blot方法檢測Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表達變化。每組實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.9"統計分析

采用SPSS 21.0軟件分析實驗數據，計量資料數據用±s表示，多組差異比較用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2"結"果

2.1"URG11 shRNA下調對骨肉瘤細胞中URG11表達水平影響

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤細胞中URG11 mRNA和蛋白表達水平明顯下降，差異有顯著性（F=181.200、97.307，Plt;0.001）。URG11 shRNA可下調骨肉瘤細胞中URG11表達和轉錄。見圖1和表2。

2.2"URG11 shRNA對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤細胞存活率降低、凋亡率升高，差異有顯著意義（F=28.897、625.516，Plt;0.05）。下調URG11可抑制骨肉瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡。見圖2和表3。

2.3"URG11 shRNA對骨肉瘤細胞侵襲和遷移影響

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤細胞侵襲和遷移數目降低，差異有統計學意義（F=93.373、101.207，Plt;0.001）。下調URG11可抑制骨肉瘤細胞侵襲和遷移。見表4。

2.4"URG11 shRNA對骨肉瘤細胞中相關蛋白表達影響

URG11 shRNA慢病毒感染后，骨肉瘤細胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達水平升高，侵襲和遷移蛋白MMP-2、MMP-9表達水平降低，間質細胞標志物Vimentin蛋白表達水平下降，上皮細胞標志物E-cadherin蛋白表達水平升高，差異均具有統計學意義（F=28.064～148.737，Plt;0.01）。下調URG11則能夠抑制骨肉瘤細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達，促進Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達，并且對細胞上皮間質轉化（EMT）具有抑制作用。見圖3和表5。

3"討"論

URG11是被HBx蛋白上調的基因，與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[7-8]。有報道顯示，在胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤中URG11高表達，下調URG11表達后腫瘤細胞生長、侵襲能力減弱，說明URG11可能在腫瘤中充當癌基因[4，9-11]。

研究顯示，URG11高表達于骨肉瘤組織，且與骨肉瘤病人存活時間、轉移等有關[6]。本文結果表明，下調URG11后的骨肉瘤細胞的增殖能力和侵襲遷移能力降低，細胞凋亡率升高，說明下調URG11可以抑制骨肉瘤細胞的惡性表型，其作用與之前在其他腫瘤中研究報道一致。

細胞凋亡受多種因素共同調控，其中Caspase蛋白家族是目前研究較為透徹的凋亡蛋白[12]。位于Caspase凋亡反應上游的蛋白成員如Caspase-9激活后可以促進凋亡反應的發生，而位于凋亡反應下游的Caspase-3激活后誘導細胞凋亡[13-14]。而且二者只有被激活后形成Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9才可發揮促細胞凋亡功能[15-16]。文獻報道，蟲草素可通過上調Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表達誘導細胞凋亡，從而發揮抗骨肉瘤的作用[17];雷公藤紅素也提高了骨肉瘤細胞HOS中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達而使細胞凋亡[18]。本文結果顯示，下調URG11表達后的骨肉瘤細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達水平升高，這說明下調URG11可能激活Caspase凋亡反應，這與細胞凋亡檢測結果一致，進一步證實了下調URG11具有誘導骨肉瘤細胞凋亡的作用。

骨肉瘤具有較高的侵襲和轉移性[19];而EMT與侵襲和遷移相關，且EMT的腫瘤細胞轉移能力更強[20]。E-cadherin和Vimentin是細胞EMT的標志[21-23]。骨肉瘤組織中E-cadherin呈低表達，而Vimentin高表達[24]。研究也顯示，沉默Vimentin能夠抑制肝癌細胞的遷移和侵襲[25]。本實驗結果顯示，下調URG11后的骨肉瘤細胞中E-cadherin水平升高，Vimentin水平降低，說明下調URG11可以抑制骨肉瘤細胞EMT。

此外，基質金屬蛋白酶也與細胞轉移相關，其可通過降解細胞外基質促進細胞轉移[26]。MMP-9和MMP-2是基質金屬蛋白酶的成員[27-28]。FOXF1-AS1通過MMP-2/-9途徑促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[29];下調MMP-9表達可抑制人骨肉瘤細胞轉移[30]。本文的實驗結果顯示，下調URG11后的骨肉瘤細胞中MMP-2和MMP-9表達水平均下降，說明下調URG11可以抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲，URG11具有抗骨肉瘤細胞轉移潛能。

總之，本文結果證實了下調URG11具有抗骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移、EMT和誘導凋亡的作用，URG11表達可能是靶向治療骨肉瘤的潛在靶點。本文結果為研究URG11在腫瘤中的作用提供了參考。本次實驗研究沒有在體內和多株骨肉瘤細胞中進行驗證，后續會對上述部分內容及其具體的調控網絡進行探索。

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