一種天灸發泡大鼠模型的建立與評價

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

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一種天灸發泡大鼠模型的建立與評價

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

(浙江中醫藥大學,杭州 310053)

探索一種穩定的天灸發泡大鼠模型的制作方法。將8只雄性SD大鼠麻醉、脫毛,稱取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏藥貼中央。吸取200mL 5%斑蝥酊均勻浸濕棉球后貼敷刺激,2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆蓋,4 h后統一收集泡液。通過觀察發泡率、泡體大小、泡液量、泡液吸收情況、發泡區域結痂情況、大鼠死亡率情況以及發泡液內總細胞數量,對本方法進行評價。200mL 5%的斑蝥酊發泡率高,泡液量和泡體大小較理想,大鼠死亡率低。用200mL 5%的斑蝥酊可以在大鼠皮膚進行穩定發泡,且操作便捷,大鼠死亡率低。

發泡療法;天灸;斑蝥酊;模型,大鼠;灸法

天灸,也稱發泡灸,是采用刺激性較強的中藥貼敷在皮膚特定穴位,使局部發熱、充血、發紅、發泡甚至化膿的一種外治方法[1]。本法具有調節免疫的作用。目前,國內外關于天灸的研究,多建立在以人為對象的臨床和實驗研究[2]。在動物實驗研究方面,以白芥子或斑蝥穴位貼敷至皮膚充血發紅來研究血清居多[3-4],鮮見大鼠天灸泡液成分和局部皮膚病理改變的研究,這與缺乏穩定的大鼠天灸發泡模型有關。模型的建立對天灸的臨床發展和機制研究必不可少[5]。為解決這一問題,本實驗選擇Sprague-Dawley(SD)大鼠,對傳統的大鼠天灸方法進行了改進和比較研究,探索出一種穩定的大鼠天灸方法,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性清潔級SD大鼠,體質量為(250±10)g,購自浙江省實驗動物中心[許可證號SCXK(浙)2014- 0001],由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養。

1.2 材料與試劑

5 cm×5 cm內圈1 cm新型PU防水空白膏藥貼、PU防水膜(連云港三瑞醫療器械制造有限公司);斑蝥粉(華東醫藥公司,批號100722);薇婷脫毛膏(利潔時家化有限公司);95%乙醇(上海展云化工有限公司);雙圈定性濾紙(杭州沃華濾紙有限公司)。

1.3 發泡方法

①5%斑蝥酊的配制,將5 g生藥斑蝥粉浸泡在95%乙醇中,定容至100 mL,7 d后過濾,4℃保存;②大鼠發泡區域的備皮,大鼠腹腔麻醉后,于項部兩耳后脊柱兩旁等距離、等面積用薇婷脫毛膏脫毛4 cm2,用生理鹽水清潔后在大鼠恒溫臺上安置,室溫控制在26℃;③發泡藥貼的準備,稱取0.018 g棉球填充于發泡藥貼的中央,輕輕按壓,以棉球剛好填充滿且不高突于發泡藥貼的中心圈為度。

1.4 PU防水膜棉球壓充法

上述準備工作完成后,吸取200mL 5%斑蝥酊均勻浸濕棉球后,貼敷于大鼠待發泡區域。發泡藥貼四周貼膜應當均勻,防止藥物揮發。2 h后加200mL斑蝥酊1次,密封覆蓋。用PU防水膜密封并繼續觀察2 h,并于4 h時統一收集泡液。操作者小心從中間區域剪下PU防水膜,用鑷子夾出棉球并沿著發泡藥貼的內側緣小心提起,觀察發泡情況。剪掉其余發泡藥貼的中心圈,保留其周圍與大鼠皮膚黏合的部分,以防止發泡區域及周圍皮膚表皮層因發泡后疏松而意外脫落,泡液流失。室溫放置,游標卡尺測量泡體的長短軸大小。詳見圖1A。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況觀察

觀察并記錄大鼠發泡前后活動反應能力、毛發情況、精神狀況、排便和日常行動等一般狀況。

1.5.2 記錄發泡率和大小

4 h后統一取下發泡藥貼,立即記錄發泡數量,并測量泡體大小。泡體大小由游標卡尺測量長短軸,計算出泡體皮膚接觸面的面積(精確到0.1 cm2)。圓面積公式為S=p(圓周率)×r2,其中π表示圓周率,r表示半徑;橢圓面積公式為S=p×a×b,其中a、b分別是橢圓的半長軸和半短軸的長。

1.5.3 觀察泡液量

用量程為20～200mL的移液槍小心抽取泡液,并保存在EP管中,記錄每只大鼠泡液量。

1.5.4 記錄泡液總細胞數量

泡液收集后用血球計數盤來計數泡液中總細胞數量,并進行統計。

1.5.5 大鼠存活率

發泡后,持續觀察大鼠1周,如有死亡則立即記錄死亡時間。

1.5.6 觀察發泡區域皮膚變化狀況

發泡后大鼠單籠飼養,1周內持續觀察,如有結痂、潰爛、紅腫和感染等情況,應詳細記錄時間。

2 結果

2.1 大鼠天灸前后一般情況變化

天灸前,大鼠皮毛均光澤順滑,精神狀態佳,行動敏捷,體質量穩定增長、糞尿正常。天灸后,直到24 h泡液完全吸收之間,大鼠狂躁多動,四處攀爬,瘙抓發泡區域。泡液完全吸收至3 d內,上述情況逐漸改善,但體重增長十分緩慢,部分大鼠出現體質量下降,飲食減少,并表現為豎毛、雜亂,毛色失去光澤。大鼠精神差,活動減少,行動遲緩。第4天開始,上述情況逐漸恢復,一直到第7天,大鼠各項生理狀況基本恢復至天灸前。

2.2 大鼠發泡率和存活率情況

8只大鼠貼敷4 h后成功發泡7只,發泡率為87.5%。7 d后,8只大鼠均存活,存活率為100%。詳見表1。

2.3 泡體大小情況

通過對泡體的測量,發現各大鼠發泡大小差異性大,最小可如米粒般,最大可以充滿整個發泡藥貼的空間,尚不能人為控制。詳見表1、圖1B。

2.4 泡液量情況

在已發泡的7只大鼠中,有5只可以成功抽取泡液,最大泡液量為200mL,其泡體的大小和泡液量基本呈現正相關。詳見表1。

2.5 泡液總細胞數量情況

泡液收集后進行統一稀釋,用血球計數盤計數,發現泡液總細胞數基本相同,為5×106/mL,并且鏡下細胞數量密集。

2.6 發泡區域皮膚變化狀況

經觀察,發泡區域皮膚主要出現結痂情況,伴隨著紅腫的出現,無潰爛和感染。大鼠結痂伴隨著發泡的出現而出現,不發泡大鼠沒有出現結痂情況。從48 h開始,逐漸開始有結痂出現;第3天(72 h前后)均有不同程度的結痂,痂塊中心區域顏色暗紅,周圍淡紅并稍透明;5 d后大部分脫落;7 d后基本完全脫離。脫落后,大鼠發泡區域皮膚逐漸恢復正常,開始有部分新生毛發。詳見圖1C。

天灸對不同發泡時長的大鼠皮膚組織結構和炎性細胞浸潤均有直接影響,突出表現在①正常大鼠皮膚組織結構完整,表皮層次、基底層、棘層以及顆粒細胞層的構成和排列都清晰,連續且完好。詳見圖1D。②當天灸刺激,水泡出現時,經HE染色觀察到皮膚顆粒層增厚(見圖1Ea);棘層松解,棘細胞間水腫(見圖1Eb);基底層細胞變性,柱狀上皮細胞變性,形態改變(見圖1Ec);炎性細胞浸潤以嗜酸性粒細胞為主,開始浸潤(見圖1Ed)。③當水泡消失,發泡區域結痂后,發現表皮脫落,棘層、顆粒層和基底層細胞均缺失,痂塊出現(見圖1Fa);嗜酸性粒細胞大量浸潤(見圖1Fb)。

表1 5%斑蝥酊大鼠發泡情況

3 討論

目前從國內外文獻來看,天灸的發泡方法多以白芥子配合其他刺激性藥物共同研末成藥餅貼敷穴位[6],或以白芥子、斑蝥單獨貼敷發泡[7],國內也有用斑蝥末和凡士林制成斑蝥膏發泡[8];國外研究則多以斑蝥素發泡為主[9-11],或用負壓拔罐的方法在人前臂進行發泡研究[12]。以上研究均是以人為對象進行天灸發泡,且發泡穩定,在此基礎上的許多研究有力地推動了傳統天灸療法的發展。但動物實驗研究方面尚未見到詳細的天灸發泡方法,有報道用不同濃度的斑蝥酊刺激大鼠皮膚,但仍難以看到水泡[13],這和動物與人皮膚的差異性、發泡方法、發泡藥物和發泡材料的選擇等諸多因素有關,也在一定程度上限制了天灸的動物實驗研究。

本實驗通過對以上天灸方法進行總結、對比[8],經過前期大量預實驗,最終選擇用斑蝥酊發泡,并篩選出了斑蝥酊發泡的最佳濃度和獨特方法,可以實現穩定發泡,具有很大優勢。在發泡材料的選擇方面,本課題組認為大鼠發泡關鍵在于持續的皮膚刺激,藥物的刺激只是一個方面,且只有在藥物與皮膚接觸面有較充足的空間時才能發泡。否則,泡液將會滲透入疏松的皮膚表皮層而難以見到泡體。故本實驗用浸濕的棉團作為填充材料,這樣既實現了斑蝥酊的持續性刺激作用,又保證了充足的空間,這是發泡的關鍵因素。對于重復加藥方法的確定,筆者發現單次給于斑蝥酊并不能發泡,這可能是由于斑蝥酊經過皮膚滲透逐漸吸收之后,發泡藥貼中剩余斑蝥酊劑量不足,不能起到持續性的皮膚表面刺激。故筆者經過進一步嘗試,在2 h時加藥1次,保證了持續性的藥物刺激,最終獲得了穩定的發泡。

在天灸發泡的評價指標方面,因本實驗是以大鼠為對象進行的發泡,在此之前,國內外文獻均無明確、詳細的實驗性大鼠天灸發泡的報道,故并無有針對性的詳細分類和判定標準。但筆者通過參考借鑒相關臨床研究[7],初步擬定了以大鼠為研究對象天灸發泡的評價指標,即以發泡率、泡體與皮膚接觸面積、泡液量、泡液吸收情況、發泡區域結痂情況、死亡率情況以及泡液總細胞數量,對本天灸發泡方法進行評價,切合臨床,具有評價意義。在發泡液內總細胞數量的計算方面,筆者發現天灸泡液中有大量細胞募集,總數量約為5×106/mL,并且發泡液最大收集的總體積可達到2 mL,這就對今后大鼠天灸發泡液內細胞以及相關因子的研究提供了可能。

另外,本課題組的另一項實驗通過對天灸敷藥后(4 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h)發泡區域皮膚組織病理學和泡液的觀察,發現皮膚不僅棘層有不同程度的肥厚和松解,而且基底層細胞也均有變性或缺失(HE染色,見圖E、F)。通過查閱相關文獻,筆者發現在天灸發泡的過程中,棘層的松解起到了關鍵性作用[14-15]。在天灸發泡液的研究方面,鄒曉軍等[16]研究發現,發泡液中大部分是中性粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞(DC),而且發泡液的DC是外周血DC的3～10倍,斑蝥的發泡作用可以局部聚集DC并促進其成熟和分化,從而達到免疫調節作用。天灸可以調節免疫,本課題組也在前期預實驗中已證實天灸發泡的性質是一種炎性刺激,還兼有疼痛刺激的成分,這兩個因素相互協同,相互存在。故筆者認為通過天灸發泡,炎性刺激和免疫調節均發揮作用,并且這種免疫炎癥反應可能主要通過DC來實現,但還需要進一步進行驗證。

斑蝥酊中發泡成分以斑蝥素為主,國外研究發現人為對象可用斑蝥素進行皮膚發泡[17-19],但筆者預實驗中用斑蝥素代替斑蝥酊,反而在大鼠皮膚沒有出現發泡的效果,這可能與人和大鼠皮膚的差異性有關。故筆者認為很可能是以斑蝥素為主的成分刺激了皮膚從而導致發泡的效果,但并不單純是斑蝥素這單一成分。斑蝥素確有肝腎毒性,經查閱相關文獻后,筆者發現近年來斑蝥素肝腎毒性的研究多以小鼠為對象進行,大鼠報道則較少,主要有腹腔注射、灌胃、膀胱灌注和直接經直腸給藥等方式[20-23]。通過參考其使用劑量,筆者發現,無論是選擇斑蝥素半數致死量(LD50,1.86 mg/kg)或斑蝥粉0.05 g/穴刺激,均對肝臟或腎臟有損傷,如鄒建軍等[20]研究發現斑蝥素腹腔注射后對小鼠肝、腎有明顯的毒性作用,其中5 h左右肝損害最嚴重,3 h左右腎臟損害最嚴重,并且其毒性隨給藥量增加而增強。劉文吉[23]通過斑蝥粉0.05 g/穴刺激,觀察天灸對大鼠肝纖維化的防治效應,發現天灸組與正常組相比,其血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平均有不同程度的增高。故筆者認為,斑蝥酊天灸發泡是一種以斑蝥素為主要成分的發泡刺激,它可以對大鼠肝腎造成一定的損傷,這考慮是造模本身對動物的不良反應。但結合上述文獻記載,筆者認為無論是參考小鼠或大鼠斑蝥的用量情況,本實驗中選擇5%的斑蝥酊濃度是在安全劑量以內。

斑蝥屬于有毒的刺激性藥物,故在實驗中應當嚴格佩戴口罩和手套,以防止呼吸道和皮膚的損傷[24-25]。在泡液收集的過程中,筆者還發現部分泡體出現了面積大但泡液少的情況,這可能和泡體表皮層疏松、泡液向周圍滲漏有關,故泡液應當及時收集,需避免大鼠過多的劇烈活動。最后,本方法也存在一定的不足之處,首先是大鼠發泡的位置不規律,尚難集中在中心區域發泡,邊緣區域發泡亦多見;其次,泡體形狀不可人為控制;再次,泡體大小差異性大。這些都需要進一步探索。

綜上所述,本實驗成功實現了SD大鼠的天灸發泡,在一定程度上復制了人體天灸的過程,模擬了臨床應用天灸的諸多特征。該模型的建立可以為天灸的實驗研究提供一定的實驗基礎和模型參考[26]。今后本課題組將會在此基礎上進行繼續嘗試和改進,以期實現大鼠發泡位置、大小和泡體形狀的人為可控性,并且基于此模型基礎上的動物天灸泡液成分以及天灸機制的實驗研究也將會是新的方向。

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Establishment and Evaluation of a Rat Model of Formation of Blisters in Vesiculation Moxibustion

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,310053,

To explore a stable method to establish a rat model of formation of blisters in vesiculation moxibustion.Eight male Sprague-Dawley (SD) rats were anesthetized and depilated. 0.018 g cotton balls were filled in the center of the PU waterproof blank paste plaster.5% cantharides tincture 200mL was drawn to soak the cotton ball evenly and then was applied. Two hours later, 200mL cantharides tincture was added once and then it was sealed. The blister fluid was collected 4 h later. This method was evaluated by observing the formation rate of blisters, the size of blister, the volume of blister fluid, the absorption of blister fluid, the scab in the area of blisters, the mortality rate of rats and the total number of cells in blister fluid.The formation rate of blisters with application of 5% cantharides tincture 200mL was high, the volume of blister fluid and the size of blister were more ideal, and the mortality rate of rats was low.The stable formation of blisters on the skin of rats can be achieved with application of 5% cantharides tincture 200mL. The operation is convenient and the mortality rate of rats is low.

Blistering therapy; Vesiculation moxibustion; Cantharides tincture; Model, Rats; Moxibustion

1005-0957(2019)13-0055-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2019.13.0055

2018-11-03

“十三五”浙江省中醫藥(中西醫結合)重點學科建設計劃(2017-XK-A18)

肖雙凱(1989—),男,2015級碩士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com