黑螵蛸多糖的制備及活性測定

梅桂雪，孫 捷，王曉靜*

（1.濟南大學 山東省醫學科學院 醫學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2.山東省醫學科學院 藥物研究所，山東 濟南 250062；3.國家衛生部生物技術藥物重點實驗室 山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南 250062）

黑螵蛸是螳螂科昆蟲巨斧螳螂（Hierodula patelliferServille）的干燥卵鞘，與團螵蛸、長螵蛸統稱為桑螵蛸，是我國傳統的昆蟲類中藥材之一[1]。桑螵蛸入藥性平，味苷、咸，有補腎、助陽、固精、縮尿等功能，主治腎陽不足、遺精、陽萎、早泄、白濁、赤白帶下、小便頻數、遺尿等癥[2]。桑螵蛸多與其他中藥配伍，用于治療小兒遺尿等癥[3]。桑螵蛸其化學成分主要有蛋白質、氨基酸、糖類、脂類等[4]。目前桑螵蛸的研究主要集中在團螵蛸，從團螵蛸植物源成分中分離得到二萜、黃酮等化合物[5]；桑螵蛸具有較強的抗氧化活性和抗動脈粥樣硬化活性，粗提物對四氧嘧啶糖尿病小鼠有良好的治療作用[6]，揮發油提取物對金黃色葡萄球菌有一定的體外抑菌效應[7]。就目前情況來看，對于黑螵蛸的研究較少，且未見黑螵蛸多糖提取分離、抗氧化、抗菌和抑制膽堿酯酶活性的研究報道。

多糖廣泛存在于微生物、動植物中，由于其各種生物學功能而受到營養和生化科學家的關注[8]。另外，已被報道的多糖大多無毒、副作用少，可潛在用于食品醫藥和化妝品行業[9]。多糖的藥理活性包括抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保肝、免疫調節和抗病毒[10-11]。多糖具有生物相容性，被認為是重要的膳食自由基清除劑，主要用于防止氧化損傷[12]。有關多糖的報道中，未見多糖抑制膽堿酯酶的研究。膽堿酯酶是一類糖蛋白，分為乙酰膽堿酯酶（AChE）和丁酰膽堿酯酶（BuChE），二者共同調節乙酰膽堿的分解，影響神經信號的傳遞，雙重膽堿酯酶抑制劑是目前最普遍認可的阿爾茨海默病（AD）治療手段。因此尋找AChE和BuChE的雙重抑制劑成為AD治療的新策略[13]。

本實驗采用水提-醇沉法制備黑螵蛸粗多糖，經DEAE Sephadex A-25離子交換柱色譜和Sephadex G-75凝膠柱色譜得到均一的黑螵蛸多糖組分。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥基自由基清除法測定黑螵蛸多糖的抗氧化能力。采用貼片法測定多糖的抑菌圈，二倍稀釋法測定其最小抑菌濃度。采用5,5’-二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）法測定多糖AChE和BuChE抑制活性，為黑螵蛸多糖進一步研發成新的抗氧化劑、抑菌劑和膽堿酯酶雙重抑制劑提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1.2 ZX-LGJ-1型真空冷凍干燥機（上海知信儀器）； LD25-2型離心機（北京醫用離心機廠）；U-3000型紫外可見分光光度計（日本日立）；Rotavapor R-200型旋轉蒸發儀（Buchi公司）；Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜儀（英國Malvern公司）；中低壓制備型液相色譜儀（博納艾杰爾公司）；XS105型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；THZ-103B 恒溫培養搖床（上海一恒）； BMJ-160型培養箱（蘇州賽恩斯）；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械）。

1.2 材料

黑螵蛸購自安國市啟航中藥材銷售有限公司，經南京中醫藥大學劉訓紅教授鑒定，樣本為巨斧螳螂（Hierodula patelliferServille）的干燥卵鞘黑螵蛸。大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌由山東省食品藥品檢驗研究院提供。

DPPH（美國Sigma公司）；維生素C（國藥集團）；碘化乙酰硫代膽堿，碘化丁酰硫代膽堿，十二烷基硫酸鈉，乙酰膽堿酯酶（來源于電鰻魚），多奈哌齊（上海麥克林）；5,5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），丁酰膽堿酯酶（來源于馬血清）（上海阿拉丁）；牛肉膏，蛋白胨（北京奧博星公司）；青霉素-鏈霉素雙抗（索萊寶）；DEAE Sephadex A-25，Sephadex G-75（源葉生物）；氯化鈉，三氯甲烷，正丁醇，無水乙醇等化學試劑均為分析純（天津富宇精細化工）。

2 方法

2.1 黑螵蛸粗多糖的提取

采用水提-醇沉淀的方法提取黑螵蛸多糖[14]：將黑螵蛸樣品置入60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥處理，用高速多功能粉碎機粉碎，備用，按料液比1:10加入蒸餾水，90 ℃加熱煮沸5～10 h，過濾，濾渣反復浸提3次后合并濾液，濃縮至一定體積，加入4倍體積的無水乙醇，攪拌均勻后于4 ℃沉淀過夜。3000 r/min離心15 min，收集沉淀，無水乙醇洗滌沉淀至醇溶液無色，將沉淀置于通風處揮發至無醇味，得黑螵蛸粗多糖，備用。采用Sevag[15]法除蛋白，將粗多糖加適量水溶解，加入等體積的由三氯甲烷:正丁醇（4:1，v/v）混合的Sevag液，于分液漏斗中混合震蕩后靜置，反復萃取除去蛋白質，上層多糖水溶液冷凍干燥后即得脫蛋白后的粗多糖。

2.2 黑螵蛸多糖的分離純化

用離子交換色譜（DEAE Sephadex A-25）和凝膠過濾色譜（Sephadex G-75）分離純化黑螵蛸粗多糖。將凍干的粗多糖粉末溶解于蒸餾水中，用DEAE Sephadex A-25中壓制備柱（2.6 cm×46 cm）進行分離純化，依次用蒸餾水和0.05～1 mol/L氯化鈉溶液以1 ml/min的流速連續洗脫，自動部分收集器收集洗脫液（每管3 ml），采用硫酸-苯酚法[16]跟蹤監測，以試管號為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制洗脫曲線，依據曲線，合并同一洗脫峰的各管洗脫液，冷凍干燥，得到多糖組分。用Sephadex G-75（2.6 cm×96 cm）中壓制備柱進一步純化多糖，用蒸餾水以1 ml/min的流速洗脫，每管5 ml，繪制洗脫曲線，合并同一洗脫峰的各管洗脫液，將得到的精制多糖組分冷凍干燥。

2.3 黑螵蛸多糖組分的紫外光譜分析

稱取多糖精制樣品適量，配制成1 mg/ml水溶液，采用紫外分光光度計進行全波長（190～900 nm）掃描，觀察圖譜是否有吸收峰。

2.4 黑螵蛸多糖相對分子質量（Mr）的測定

采用凝膠滲透色譜測定多糖Mr，示差光檢測器監測。儀器：Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜儀；色譜柱：AGuard+1xA6000M；流動相：0.1 mol/L NaNO3+0.02% NaN3；流速：0.7 ml/min；檢測器溫度：35 ℃；柱溫：35 ℃；進樣量：100 μl。

2.5 黑螵蛸多糖的抗氧化活性檢測

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定[17]精密稱取DPPH樣品10 mg，用無水乙醇溶解，定容于250 ml棕色量瓶（濃度0.1 mmol/L），0～4 ℃避光保存。試管中加入DPPH溶液2 ml，樣品溶液1 ml，室溫下避光靜置30 min，測定517 nm處吸光度Ai；以蒸餾水1 ml代替樣品溶液1 ml測得吸光度A0；以無水乙醇2 ml代替DPPH溶液2 ml測得吸光度Aj；每個樣品做3個平行，按以下公式計算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

以半數抑制率（IC50）表示DPPH自由基清除能力，提取物的IC50值越小，表示其抗氧化能力越強。

2.5.2 羥基自由基清除能力測定[18-19]分別取1 mmo1/L FeS04（用10 mmoL/L H2SO4溶液配置），1 mmo1/L水楊酸（用無水乙醇配置），0.03%H2O21 ml于10 ml試管中，再加入1 ml不同濃度的樣品溶液。以1 ml 0.3% H2O2啟動反應，3 ℃水浴30 min，以蒸餾水作為空白對照，維生素C作為陽性對照，測定510 nm處反應液的吸光值A1。以1 ml蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度A0；以1 ml無水乙醇代替水楊酸測得吸光度A2；每個樣品做3個平行，按以下公式計算清除率（IC50）。

羥基自由基清除率（%）=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

2.5.3 數據處理 用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對結果進行方差分析，比較各組實驗效果。

2.6 黑螵蛸多糖的抗菌活性測定

稱取適量黑螵蛸精制多糖樣品，用蒸餾水配制成50 μg/ml的溶液，無菌過濾器過濾除菌，4 ℃冰箱保存備用。將牛肉膏蛋白胨固體培養基（加瓊脂）倒入培養皿中，冷卻備用。倒取適量牛肉膏蛋白胨液體培養基（不加瓊脂）于試管中，接種環沾取菌株于試管中，37 ℃、100 r/min于恒溫培養搖床中培養。待培養基變渾濁（有菌生長）后，吸取少許菌懸液于固體培養基上，涂布器均勻涂布，37 ℃培養箱中培養。將浸潤黑螵蛸多糖、青霉素和鏈霉素的濾紙片（每個濾紙片直徑6 mm） 貼在已涂布菌種的培養基上，37 ℃培養18～24 h。觀察抑菌圈的有無及其大小，即可判斷其敏感性，統計抑菌圈直徑。抑菌效果判斷標準為：D≤8 mm為不敏感，8 mm＜D≤13 mm為低度敏感，13 mm＜D≤19 mm為中度敏感，D＞19 mm為高度敏感），采用二倍稀釋法[20]測定有抑菌效果樣品的最小抑菌濃度（MIC）。

2.7 黑螵蛸多糖膽堿酯酶抑制活性測定

2.7.1 AChE抑制活性測定 采用改良的Ellman方法[21]測定AChE抑制活性。用PBS（pH 8.0，0.1 mol/L）配制濃度為0.2 U/ml乙酰膽堿酯酶溶液（50 mg酶用水定容到50 ml），0.75 mmol/L DTNB溶液，1.5 mmol/L碘化乙酰硫代膽堿，3%SDS終止液。依次向試管中加入 PBS（pH 8.0，0.1 mol/L）2.65 ml，DTNB 100 μl、不同濃度的樣品100 μl、酶溶液50 μl，37 ℃水浴中預熱5 min，加入底物100 μl，37 ℃水浴溫浴20 min，迅速加入3%SDS 1 ml終止反應，測定412 nm處吸光度A1。以100 μl 甲醇代替樣品溶液測得吸光度A0；以100 μl PBS代替底物測得吸光度A2；按下式計算AChE半數抑制率（IC50）。

AChE抑制率（%）=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

2.7.2 BuChE抑制活性測定 采用改良的Ellman方法，具體操作步驟與AChE測定方法相同。只是將AChE抑制活性測定中的底物碘化乙酰硫代膽堿替換成碘化丁酰硫代膽堿，其他反應溶液配制和具體操作步驟與AChE抑制活性測定時相同。

3 結果與討論

3.1 黑螵蛸多糖提取與分離

黑螵蛸多糖經DEAE Sephadex A-25陰離子交換柱分離，硫酸-苯酚法檢測，得到2個單一洗脫峰，洗脫曲線見圖1。洗脫峰1是水洗脫產物，為中性多糖。洗脫峰2是鹽洗脫產物，為酸性多糖。合并峰1、峰2，冷凍干燥，峰2的量不足5 mg不作為重點研究對象。峰1為主要組分，命名為H-1。

圖1 黑螵蛸多糖DEAE Sephadex A-25色譜柱洗脫曲線

H-1經Sephadex G-75凝膠分子篩純化，洗脫曲線見圖2。洗脫后得到對稱單峰，命名為HPP-1，初步說明獲得了Mr均一的多糖組分。

圖2 黑螵蛸多糖H-1經DEAE Sephadex G-75色譜柱純化洗脫曲線

3.2 黑螵蛸多糖紫外光譜分析

黑螵蛸精制多糖HPP-1紫外掃描結果見圖3。由圖3可見，該多糖在200 nm處有多糖吸收峰。核酸的特征吸收波長為260 nm，蛋白質的特征吸收波長為280 nm，色素的特征吸收波長為620 nm，圖3顯示該多糖在以上3個波長處均無吸收峰，表明HPP-1不含核酸、蛋白質和色素。

圖3 HPP-1的紫外掃描光譜

3.3 黑螵蛸多糖Mr的測定

對精制黑螵蛸多糖進行凝膠滲透色譜分析，示差光檢測器檢測，經儀器計算得黑螵蛸精制多糖Mr為13 048。

3.4 黑螵蛸多糖的抗氧化活性

黑螵蛸多糖HPP-1的DPPH自由基和羥基自由基清除活性測定結果見表1。由表1可見，HPP-1對DPPH自由基有清除作用，但清除能力稍弱于維生素C。HPP-1對羥基自由基清除能力較強，強于陽性對照維生素C。羥基自由基能與體內的脂類、蛋白質、核酸、多肽等物質發生反應，對體內的生物大分子有很強的氧化破壞效應，對細胞和組織產生氧化損傷，引起組織器官病變，導致機體衰老[22]。黑螵蛸多糖HPP-1羥基自由基清除能力較強，能阻止其與生物體內的生物大分子發生反應，減輕氧化破壞效應引起的細胞與組織損傷。

表1 HPP-1的抗氧化活性

3.5 黑螵蛸多糖的抗菌活性

HPP-1對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性測定結果見表2，以稀釋200倍的青霉素-鏈霉素雙抗作為陽性對照。由表2可見，HPP-1對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑小于8 mm，屬于不敏感，在實驗濃度范圍內無抑制作用。HPP-1對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑大于19 mm，屬于高度敏感，抗菌作用最強。HPP-1對枯草芽孢桿菌的MIC為18.8 μg/ml。

表2 HPP-1的抗菌活性

3.6 黑螵蛸多糖的膽堿酯酶抑制活性

AChE抑制活性測定基本原理是以碘化乙酰硫代膽堿為底物，其在AChE的作用下發生分解反應生成硫代膽堿，與顯色劑DTNB迅速反應生成5-巰基-2-硝基苯乙酸，該物質在412 nm處有可見光吸收。若待測提取物對AChE有抑制作用，則反應產物吸收度降低。具體測定結果見表3。由表3可見，HPP-1對AChE和BuChE均有抑制活性。

表3 HPP-1的AChE和BuChE抑制活性

4 結論

采用水提-醇沉方法提取黑螵蛸粗多糖，經DEAE Sephadex A-25離子交換柱色譜和Sephadex G-75凝膠柱色譜分離純化得到均一的黑螵蛸多糖組分HPP-1，Mr為13 048，且多糖純度較高，不含核酸、蛋白質和色素。HPP-1對DPPH自由基和羥基自由基均有清除活性，其中羥基自由基清除活性強于陽性對照維生素C，對枯草芽孢桿菌有較強的抑制活性，表明黑螵蛸多糖在天然抗氧化劑、抗菌劑方面有極大的開發潛力。另外實驗首次發現HPP-1對AChE和BuChE均有抑制活性。目前批準上市的膽堿酯酶抑制劑都伴隨不同程度的毒副作用，多糖類藥物來源廣泛，具有多種生物學活性，安全無毒副作用，且藥物質量通過化學手段容易控制，因此，多糖類藥物成為當今功能保健品和綠色食品添加劑研究的一大熱點。