HPLC同時測定退黃保肝膠囊中3種成分的含量

畢春艷，薛劍橋，翟兆玲

（淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086）

退黃保肝膠囊是由赤芍、茵陳、白術、枳殼、梔子、郁金、丹參、金錢草等十五味藥組成，有疏肝健脾，清利濕熱，利膽退黃的作用，用于急慢性黃疸型肝炎。方中茵陳為君藥，具有清利濕熱，利膽退黃[1]的功效，其中綠原酸為其主要成分之一。現代研究表明綠原酸是一類分布廣泛且有諸多藥理作用的天然化合物，具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌變、降血脂和降血壓、保護心血管和中樞神經、抑制糖尿病、抗紫外和抗輻射、抗白血病、免疫調節、細胞保護、保肝、抗內毒素、抗抑郁和焦慮等多方面的藥理作用[2]。枳殼為臣藥，現代研究表明，枳殼主要含黃酮、生物堿、揮發油等化學成分，且具有廣泛的藥理作用，常作為理氣藥，對脂肪肝引起的轉氨酶升高和肝內脂肪浸潤、肥胖、高脂血癥進行治療和調理[3]。枳殼的藥典主要質控成分為柚皮苷和新橙皮苷[1]。為提高退黃保肝膠囊的質量標準，保障臨床用藥安全，本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定該制劑中綠原酸、柚皮苷和新橙皮苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），配備SPD-20A UV/VIS檢測器、LC-solution工作站；Mettler Toledo MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；BWS-10恒溫水浴鍋（上海一恒公司）。

1.2 材料

綠原酸對照品（批號110753-201415，含量以96.2%計），柚皮苷對照品（批號110722-201613，含量以94.3%計），新橙皮苷對照品（批號111857-201102，含量以99.6%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；退黃保肝膠囊3批，批號分別為170318，170412，170521，均為醫院制劑；液相用乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18Superb（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）；流速為1.0 ml/min；檢測波長為283 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對照品儲備溶液。臨用時，精密吸取上述3種對照品儲備溶液各1 ml，置5 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內容物約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按照退黃保肝膠囊處方制備不含茵陳、枳殼的樣品，按2.2.2項方法操作，制得陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別精密吸取2.2項下3種溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件測定，記錄色譜圖。結果表明，供試品呈現與對照品保留時間一致的色譜峰，陰性樣品在對照品的保留時間處，無色譜峰干擾（見圖1）。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關系考察

精密吸取2.2.1項下對照品溶液1，5，10，20，30 μl，注入高效液相色譜儀，依法測定峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得綠原酸回歸方程為Y=2×106X-523，r=0.9999，柚皮苷回歸方程為Y=2×106X+388，r=0.9999，新橙皮苷回歸方程為Y=2×106X+436，r=0.9996，結果表明，綠原酸在0.0387～1.1610 μg、柚皮苷在0.0399～1.1970 μg、新橙皮苷在0.0414～1.2420 μg范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下對照品溶液10 μl，重復進樣6次，記錄峰面積。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.41%，0.35%，0.36%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批（批號為170318）樣品，按2.2.2項方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項色譜條件測定。結果，綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷平均含量分別為1.3398，1.8978，2.2241 mg/g，RSD分別為0.9%，1.0%，1.2%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一批（批號為170318）樣品，按2.2.2項方法制備供試品溶液，分別于0，6，9，12，18，21，24 h按規定的色譜條件測定峰面積。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷峰面積的RSD分別為0.19%，0.31%，0.27%（n=7），表明供試品溶液在24 h內質量穩定性。

2.8 加樣回收試驗

分別取同一批已知含量的樣品（批號為170318）約0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入綠原酸對照品儲備溶液、柚皮苷對照品儲備溶液、新橙皮苷對照品儲備溶液3，5，5 ml，揮干甲醇，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，計算加樣回收率。結果綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為99.7%，99.3%，99.6%，RSD分別為0.9%，1.3%，1.1%（n=6）。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為170318，170412，170521），分別按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定，計算各成分含量，結果見表1。

表1 供試品中綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷含量測定（n=3）

3 討論

3.1 波長的選擇

分別取綠原酸、柚皮苷、新橙皮苷對照品溶液在200～500 nm波長范圍內掃描，最大吸收波長分別為327，283，283 nm，因在283 nm得到的峰形、峰高最為適宜，故選用283 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

對比了乙腈-0.4%磷酸溶液（13:87）[1]，乙腈-0.1%磷酸溶液（10:90）[4]，乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）[5]，乙腈-水（20:80）[6]，乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（16:10:74）[7]的分離效果，結果表明以乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動相時，樣品中各組分的分離度最好，故采用乙腈-0.2%磷酸溶液（15:85）為流動相。

3.3 提取溶劑和提取時間的確定

分別考察了以50%甲醇[7]、70%甲醇、75%甲醇[8]、甲醇[6]、50%乙醇、70% 乙醇[9]、 90%乙醇、乙醇為溶劑的加熱回流提取效果，結果表明70%甲醇提取效果優于其他溶劑。同時對提取時間進行了考察，結果表明加熱回流60 min能提取完全，故確定用70%甲醇加熱回流提取60 min。