基于低場核磁共振技術(shù)的不同品牌黃明膠的快速鑒別初探

程素盼，姜姣姣，趙恒強，郭興峰，張渝潔，崔 莉，王 曉，耿巖玲*

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014；3.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059；4.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005）

黃明膠（cattle-hide glue）作為養(yǎng)血止血良藥載于《部頒標準》，是牛科動物黃牛的皮經(jīng)熬制并佐以黃酒、豆油等加工而成，性味甘平，主入肺、大腸經(jīng)，具有滋陰潤燥、養(yǎng)血止血的功效，臨床上常用于治療體虛便秘、腎虛遺精、吐血、嘔血，胎漏、崩漏等癥[1-4]。近年，隨著消費者健康養(yǎng)生意識的逐步提高，膠類藥材成為消費者日常滋補的選擇之一，其中阿膠與黃明膠都是比較常見的滋補膠類藥材，既可作為藥品，又可作為普通食品[5-7]。目前市場上以阿膠為貴，阿膠的偽品較多且倍受重視，相較而言，黃明膠作為一味已上市的非處方藥報道很少[1]，尚未實現(xiàn)不同品牌黃明膠的區(qū)分辨識[8]，亟需一種簡便、快速、無損的鑒別不同品牌黃明膠的方法。

目前，膠類藥材的鑒定技術(shù)主要有：液質(zhì)聯(lián)用檢測多肽片段[8]，雙向凝膠電泳[9]及DNA鑒定技術(shù)[10]。膠類藥材被酶解后，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）進行多肽識別，需要大量的測試、對比及后期驗證工作，若在此基礎(chǔ)上建立不同膠類藥材酶解的特異性肽段及質(zhì)譜信息庫，對于實現(xiàn)膠類藥材的專屬性鑒別有重要價值，但如何找到一個可切割出盡量多特征肽段的蛋白酶難度較大。雙向電泳與單獨的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF-PAGE）相比，其分辨率更高，可直觀地找出具有差異性的蛋白點，是目前較常見的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，但缺點是樣品中鹽、脂質(zhì)等對此法影響嚴重且重現(xiàn)性較差。DNA鑒定法對于含其他種源性成分的膠類藥材可進行準確判斷，但成本高。因此開發(fā)一種快速、有效且操作簡便的檢測方法，是十分有意義的。

低場核磁共振（LF-NMR）是一種可靠的、信息豐富的非侵入性分析技術(shù)，可探尋天然產(chǎn)物中小分子的質(zhì)子，因其快速、無損等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于對食品和藥物的質(zhì)量控制研究[11-18]。相比傳統(tǒng)的膠類鑒定手段，LF-NMR技術(shù)具有諸多獨特優(yōu)勢[19-20]：（1）過程簡便，無需復(fù)雜的前處理；（2）安全性好；（3）檢測速度快；（4）無損：無需加入試劑、不浪費樣品，特別適合價格昂貴樣品的真?zhèn)舞b別。本研究以不同廠家黃明膠為研究對象，結(jié)合主成分法（PCA）對所獲得的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列回波峰點數(shù)據(jù)進行分析處理，為探索LF-NMR鑒別不同品牌黃明膠提供試驗依據(jù)。

1 儀器與材料

NMI20-Analyst核磁共振分析儀（上海紐邁）；飛利浦料理機HR2874/00（飛利浦電子公司）；ME20型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多）。5個不同廠家黃明膠樣品具體信息見表1。

表1 黃明膠樣品來源

2 方法

2.1 樣品制備

將表1中5個不同品牌黃明膠樣品分別經(jīng)料理機粉碎后，過40目篩，備用。

2.2 樣品檢測

取樣品粉末10 g，置入20 mm核磁管底部，于35 ℃下使用LF-NMR在CPMG脈沖序列下采集信號，設(shè)置參數(shù)如表1，每類樣品設(shè)置8個平行樣品，每個樣品重復(fù)測定3次，求取平均值。

表2 應(yīng)用脈沖序列參數(shù)

2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Multi Exp Inv Analysis軟件對不同品牌黃明膠樣品CPMG回波峰點數(shù)據(jù)進行反演擬合，并使用SPSS 22.0軟件對反演后的T2弛豫時間、峰面積S2及峰面積所占比例P進行主成分分析（PCA），采用Origin 8.5對結(jié)果進行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品牌黃明膠的T2反演圖譜

圖1顯示了5個不同品牌黃明膠的橫向弛豫時間圖譜，由圖1可見，5個不同品牌的黃明膠均包含3個峰：T21、T22和T23。5個品牌黃明膠進行兩兩比較，弛豫時間T2和峰面積S2均明顯不同。LF-NMR結(jié)果見表3。由表3可見，任取2個不同品牌的黃明膠進行對比，6個變量中至少有4個變量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 不同品牌黃明膠LF-NMR結(jié)果

圖1 不同品牌黃明膠的橫向弛豫圖譜

3.2 不同品牌黃明膠的PCA結(jié)果

主成分分析（principal component analysis，PCA）是模式識別中較常用的多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法[21]。在不丟掉原來主要信息的前提下，從多個數(shù)值變量（指標）之間的相互關(guān)系入手，利用降維的思想，將原來的多個指標組合成少數(shù)幾個互不相干的綜合指標，形成特征向量。利用降維后的特征向量作PCA散點圖，使數(shù)據(jù)可視化，進而直觀地反映樣品之間的整體差異。

選取反演后得到5個品牌黃明膠樣品信息的9個變量（T21、T22、T23峰起始時間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P）進行PCA，根據(jù)PCA原理，主成分1為圖2中橫坐標，主成分2為縱坐標，其中包含了各主成分在PCA轉(zhuǎn)換中的貢獻率。總貢獻率大于70%～85%的方法即可使用[22-24]，貢獻率越大，說明主成分可較好地反映原始變量信息。圖2為5個品牌黃明膠前兩個主成分PC1和PC2的得分圖，圖中每個樣品的整體特性用一個圈表征，其中8個小點代表此樣品的平行樣品。不同樣品類間品質(zhì)差異與樣品間隔距離成正比，距離越遠樣品品質(zhì)差異越大[25]。

圖2 不同品牌黃明膠的PCA得分圖

根據(jù)表3不同品牌黃明膠之間差異性比較，將反演后得到的9個變量（T21、T22、T23峰起始時間、峰面積S21、S22、S23及相應(yīng)峰面積所占比例P）均進行PCA。PC1和PC2得分累積貢獻率為97.38%，其中PC1的貢獻率為91.73%，即保留了91.73%的原始數(shù)據(jù)信息，PC2包含了5.65%的信息。由圖2可見，5種不同品牌的黃明膠分布距離較遠，雖在PC1軸上得不到準確區(qū)分，但結(jié)合PC2軸后，均能兩兩區(qū)分開來，推測是由于不同品牌黃明膠生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)用水、所用輔料等存在一定的差異[25]，導(dǎo)致LF-NMR結(jié)果存在明顯差異，在PCA得分圖上被很好地體現(xiàn)出來。

4 結(jié)論

LF-NMR作為一種現(xiàn)代化檢測分析技術(shù)，在鑒別不同品牌膠類藥材中具有較大的應(yīng)用潛力，無需添加其他化學(xué)試劑和復(fù)雜前處理，樣品不受污染與破壞，制樣方便，耗時短，屬于一種非破壞快速檢測手段。結(jié)果表明，結(jié)合PCA，LF-NMR能有效地反應(yīng)出不同品牌黃明膠的差異，從而實現(xiàn)對不同品牌黃明膠的區(qū)分、辨識。