大麥蛋白質含量與SSR標記的關聯分析

司二靜，楊淑蓮，孟亞雄，李葆春，馬小樂， 汪軍成， 任盼榮，姚立蓉，張 宇，王化俊

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅農業大學農院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農業大學檔案館，甘肅蘭州 730070； 4.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州 730070；5.甘肅省種子管理局，甘肅蘭州 730020)

大麥作為全球第四大禾谷類作物，因其較強的抗旱、耐貧瘠和耐鹽性被廣范種植，且具有良好的飼用、食用和啤用價值。籽粒蛋白質含量是決定大麥用途的重要性狀之一，飼用、食用和啤用大麥對籽粒蛋白質含量要求不盡相同，如啤用大麥蛋白質含量一般要求在9.0%～12.0%之間，而飼用和食用大麥則蛋白質含量越高越好，優質飼用和食用大麥的籽粒蛋白質含量一般要求大于13.0%[1]。大麥籽粒蛋白質含量受環境條件影響，但主要由遺傳因素控制[2]，且由主效基因和若干微效基因共同控制[3]。Marquez-Cedillo等[4]利用雙單倍體群體對麥芽質量相關性狀進行QTL定位，分別在2H、4H和5H上檢測到與大麥蛋白質含量相關的QTL，標記區間依次為vrs1-MWG503、INT-C-HVM40和MWG635d-ABC302a。

關聯分析通過對關聯群體的候選基因檢測或者分子標記掃描，得到豐富的基因位點及其等位基因信息，進一步與相關性狀關聯，分析鑒定出對其目標性狀有正向貢獻的優異等位基因[5]。在小麥[6-7]、玉米[8-9]、水稻[10-11]和大麥[12-16]等作物中均有關聯分析應用的報道，已有對大麥性狀的關聯分析主要涉及耐脅迫[12-13]、抗病[14-16]、農藝性狀[17-20]等，而關于以大麥籽粒蛋白質含量為目標性狀進行關聯分析的研究還未見報道。

本研究擬運用SSR標記對大麥材料進行群體結構分析，并通過SSR標記與目標性狀的關聯分析，探討與大麥蛋白質含量相關聯的SSR標記，為大麥的分子輔助選擇育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的93份大麥材料由甘肅農業大學甘肅省干旱生境作物學重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室麥類種質創新課題組和甘肅省農業科學院大麥研究所提供，來源及編號見表1。2015年3月將93份大麥材料點播種植于甘肅農業大學黃羊鎮實驗田。采用常規田間管理，成熟期收獲并測定蛋白質含量。

表1 供試材料來源Table 1 Origin of materials used in the study

1.2 籽粒蛋白質含量的測定

用近紅外線分析儀(Foss NIR system)測定大麥籽粒蛋白質含量。

1.3 SSR標記分析

在直徑9 cm培養皿中進行不同大麥品種萌發，22 ℃黑暗培養2周后采集大麥葉片，在研缽中添加液氮后進行樣品研磨，運用CTAB法[21-22]提取基因組DNA，-20 ℃保存備用。參考Grain Genes 2.0網站、Korff等[23]構建的遺傳圖譜、司二靜等[20]研究結果，按遺傳距離選取93個均勻分布于大麥1H～7H染色體的SSR標記(表2)對93份大麥材料的DNA進行PCR擴增 。擴增體系為10 μL，包括5 μL 2×MasterMix (BIOTEKE，PR1701)，上下游引物各1 μL(10 μmol)，1 μL模板(60 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。擴增程序為95 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，64～55 ℃(touch-down PCR)50 s，72 ℃ 50 s，10個循環；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

每對SSR引物擴增的每一條帶記為1個位點，基因型以大寫字母A、B、C等表示。運用Power marker V3.25對93個標記進行多態性統計；以Structure 2.3.1軟件進行群體結構分析，估計最佳群體數K，其取值范圍為1～10，將參數iterations設為10 000，burn-in period 設為100 000，每個K值重復運行5次，依據似然值最大原則選取合適的K值為群體數目[24]。當K值持續增大時，參照Evanno等[25]方法計算ΔK，選擇合適的K值，計算Q參數，將其作為協變量，運用Tassel 2.1軟件一般線性模型(general linear model，GLM)，將Q作為協變量進行回歸分析，混合線性模型(mixed linear model，MLM)采用Q+K方法，分析方法選擇EM，運用蛋白質含量與分子標記數據，并結合群體結構數據進行SSR-蛋白質含量關聯分析，確定與蛋白質含量相關聯的位點。

2 結果與分析

2.1 供試大麥的蛋白質含量

供試的93份大麥材料中，蛋白質含量變化范圍為8.4%～15.8%，西安91-2含量最高(15.8%)，其次為EMPRESS(15.4%)，而法爾非特的蛋白質含量最低(8.4%)；蛋白質含量平均為11.7%，標準差為1.7，變異系數是14.6%。不同來源大麥材料的蛋白質含量差異程度不同，來源于匈牙利的大麥(5)蛋白質含量較高，平均為12.9%；來源于德國(19)、美國(25)、日本(4)、中國(34)的大麥平均蛋白質含量依次為11.5%、11.7%、11.9%和11.9%，而來源于敘利亞(2)的大麥平均蛋白質含量最低，為10.8%。來源于澳大利亞、波蘭、丹麥和法國的大麥材料均為一份，蛋白質含量依次為12.2%、10.0%、10.4%和12.8%。國內不同省份大麥材料蛋白質含量差異較大，來源于山東的大麥平均蛋白質含量最高，為12.9%，來源于福建、浙江、甘肅和內蒙古的平均蛋白質含量依次為12.6%、12.3%、11.3%和10.6%，來源于北京、湖北、江蘇、山西、陜西和西藏均為1份材料，蛋白質含量依次為13.7%、13.4%、9.0%、11.9%、15.8%和14.3%，來源于國家庫的兩份永久保存大麥材料平均蛋白質含量為11.2%。

2.2 SSR標記分析

利用93個SSR標記對93份大麥材料進行多態性分析，共檢測出等位變異406個，變化范圍為2～9，其中，標記Bmac40和Bmag0225的等位變異最多，均為9個，其次是Bmag0872、Bmag603和Bmag0812，均為8個，有8個標記(HVABAIP、HVM54、MGB334、MGB384、Bmac0163、HVM31、GBM1140和GBM1456)的等位變異較少，均為2個。基因多樣性變化范圍為0.021 3～0.862 0，平均為0.575 6；PIC變化范圍為0.021 0～0.648 5，平均為0.521 4，基因多樣性和PIC均以標記Bmac40最高，GBM1140最低(表2)。以PIC≥0.5為高多態性位點，0.25

表2 93對SSR多態性統計Table 2 Polymorphic statistics of 93 SSR markers

(續表2 Continued table 2)

(續表2 Continued table 2)

2.3 群體結構分析

運用多態性較好的引物對93份大麥材料進行群體結構分析。由圖1A可以看出，隨著K值增大，LnP(D)持續增大，無明顯拐點，故不能判斷亞群數，需要通過ΔK來進一步確定該群體的亞群數[25]。由圖1B可以看出，在K=5時出現明顯峰值，供試材料被劃分為5個亞群，分別包含18、23、15、22和15份材料(圖1C)。當某個品種在某亞群中的Q≥0.6時，認為該品種來源較為單一，若小于0.6則認為有混合來源[26]。93材料中，Q<0.6的材料有34份，占總數的36.56%，表明這34份材料來源背景復雜，而Q>0.6的材料有59份，占總數的63.44%，表明這些材料來源較為單一。

A：LnP(D)值隨K值變化折線圖；B：ΔK 值隨K值變化折線圖； C：93 份材料分為5個亞群。

2.4 SSR標記與蛋白質含量關聯分析

運用不同大麥材料的蛋白質含量與93個SSR標記進行關聯分析，GLM模型檢測結果顯示，所檢測的93個SSR標記中，共檢測到9個與大麥蛋白質含量顯著相關的標記(P<0.05)，對表型變異的解釋率在7.49%～14.13%間，分布于染色體3H、4H、5H、6H和7H上，其中，位于染色體5H上的標記GMS061與蛋白質含量極顯著相關(P<0.01)，表型變異解釋率為13.98%。MLM模型所檢測到的SSR標記相關性與GLM結果一致，但MLM中關聯標記的變異解釋率較GLM低，對表型變異的解釋率為7.30%～13.97%，標記GMS061與蛋白質含量的相關也達到極顯著水平，對表型變異的解釋率為13.84%。

表3 與蛋白質含量相關的標記P值及其對表型變異的解釋率Table 3 Significance and explained phenotypic variation of the marker associated with barley protein content

3 討 論

籽粒蛋白質含量是衡量大麥品質的一個重要指標，如優級啤麥、一級啤麥和二級啤麥對籽粒蛋白質含量的要求分別是≤12.0%、12.0%～12.5%以及12.5%～13.5%[27]。本研究中，蛋白質含量在9.0%～12.0%之間的材料共51份，占總材料的54.8%，而蛋白質含量在12.0%～12.5%和12.5%～13.5%的分別包含7份和15份，分別占總材料的7.5%和16.1%，其蛋白質含量均符合啤用大麥要求；蛋白質含量大于13.5%的材料共17份，占總材料的18.3%，可食用和飼用。供試大麥蛋白質含量為8.4%～15.8%，平均為11.7%，與許如根等[28]和馬得泉等[29]研究結果不同，這可能與供試大麥材料來源和數量有關，許如根等[28]僅選用國內7個大麥品種，而本研究大麥材料來源更廣泛；馬得泉等[29]選用的是西藏野生大麥，而西藏野生大麥蛋白質含量較高[30]。大麥籽粒蛋白質含量不僅受基因型控制，還受其他因素影響，如氣象因子、栽培措施和環境條件等[31]，這些因素影響程度的確定還需進行多年多點試驗。

因群體結構能增加染色體間的連鎖不平衡，致使目的性狀與不相關位點表現出關聯，即造成了偽關聯，因此關聯分析前需要進行群體結構分析，進而減少群體結構對關聯分析結果的影響，避免人為因素對亞群劃分的影響，通過降低偽關聯概率提高關聯分析結果準確性[32-33]。本研究中，經群體結構分析，供試材料被劃分為5個亞群，并將Q值作為協變量納入計算，在一定程度上降低了亞群混合造成的偽關聯概率[34]。蛋白質含量相關QTL報道較少，只在2H、4H和5H上鑒定到，本研究經GLM和MLM模型分析均將9個與蛋白質含量相關的SSR標記定位在3H、4H、5H、6H和7H上，只有標記HVM40與Marquez-Cedillo等[4]結果一致，而其他8個標記與前人研究結果差異較大，需進一步驗證標記的可靠性。本研究中，MLM模型檢測到的關聯標記對表型變異的解釋率較GLM中檢測到的關聯標記對表型變異的解釋率低，主要原因可能是MLM模型不僅考慮群體結構Q的影響，還考慮了親緣關系K對關聯分析的影響，結果比較準確可靠。