花藥培養與麥谷蛋白亞基分子標記結合選育小麥新品種的研究

王 煒 ,陳 琛 ,葉春雷,楊隨莊,歐巧明,羅俊杰

(1.甘肅省農業科學院生物技術研究所，甘肅蘭州 730070；2.西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

麥谷蛋白是小麥貯藏蛋白的主要成分之一，麥谷蛋白亞基的組成和含量對小麥品質形成具有重要作用[1]。近年來，若干麥谷蛋白亞基基因功能分析、分子標記的開發為進行小麥品質改良提供了有力支撐[1-2]。隨著農業供給側改革的展開，小麥的育種目標逐步從高產、抗病轉向優質專用，以滿足人們多方面、多層次的需求。在小麥育種的早期世代，由于品質性狀表型較難區分，對大量材料進行品質檢測則成本高昂，利用與品質相關的麥谷蛋白亞基分子標記進行輔助選擇，在一定程度上可提高育種效率并節省成本。

花藥培養具有縮短育種時間并提高育種效率等優點，是單倍體育種技術中應用最成功和最廣泛的方法。然而由于基因型依賴性、誘導率和分化率低等諸多原因[3]，與傳統常規育種相比，應用該技術育成的品種偏少。近年來的研究表明，包含花藥培養在內的單倍體育種技術可與分子標記輔助選擇技術和轉基因技術等現代生物技術有機結合，使有益基因快速聚合[3-4]，進而進行種質資源創制和新品種選育，該項技術重新得到相關研究者的重視[5]。本研究以矮敗小麥群體為平臺，通過對其與優質材料的雜交后代進行花藥培養，并結合麥谷蛋白分子標記檢測，進行小麥新品種的選育，為提升小麥品質育種技術水平提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

矮敗小麥材料由甘肅省農業科學院作物研究所提供；用于矮敗小麥群體改良的種質資源材料和尚頭、甘春20號、臨麥34號、隴春23號、隴春27號、隴春29號、銀春8號由甘肅省農業科學院小麥研究所提供，寧春4號、隴春31號、定豐16號和200706由本研究室提供。其中，和尚頭、甘春20號具有優良的營養加工品質；寧春4號、隴春27號、隴春31號和200706具有優良的花培特性；寧春4號、定豐16號、隴春23號、隴春27號、隴春31號、定豐16號、臨麥34號和銀春8號的綜合性狀優良，是近些年來甘肅中部地區重要的栽培品種。

1.2 方 法

1.2.1 矮敗小麥改良群體組建

依照王世紅等[6]的方法，將和尚頭、甘春20號、臨麥34號、隴春23號、隴春27號、隴春31號、定豐16號、寧春4號、銀春8號和200706的種子等量混合作為混合父本，與引進的矮敗小麥群體材料按行數比1∶2播種，行長3 m，行距0.2 m，共種植120行，面積為72 m2，成熟后收獲全部籽粒；次年按上述方法繼續播種，并淘汰不良可育株。連續進行3年(2013-2015)。

1.2.2 花藥培養

2013年按照文獻[7]的方法進行花藥培養并統計花培特性相關指標。其中，接種矮敗小麥材料30瓶，用于改良群體的種質資源材料10瓶，每瓶60枚花藥，3次重復。2016年接種矮敗小麥改良群體材料736瓶，約44 160枚花藥。

1.2.3 分子標記檢測

選取3個HMW-GS(Bx7、Bx14、Dx5)和3個LMW-GS(Glu-A3ac、Glu-A3d、Glu-B3b)特異標記引物，2016年對花藥培養所獲得的115份花培后代材料進行麥谷蛋白亞基分子標記檢測，標記引物相關信息見文獻[8]。PCR反應體系(15 μL)：模板DNA 50 ng，2×Taq MasterMix(中科瑞泰北京生物科技有限公司)7.5 μL，標記基因上下游引物(10 μmol·L-1)(上海生工)各0.6 μL，用雙蒸水補充反應體系至15 μL。Bx7和Dx5的PCR擴增程序參照蘆 靜等[9]的方法；Bx14的擴增程序參照王 欣等[10]的方法，Glu-A3ac、Glu-A3d和Glu-B3b的擴增程序參照Wang等[11]的方法。1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠(EB)染色。緩沖體系為1×TAE溶液，120 V電壓下電泳30 min，紫外成像系統掃描成像。

1.2.4 農藝性狀鑒定

2017-2018年按照常規育種方法對44份含有4種及4種以上麥谷蛋白亞基的花培小麥株系進行了連續2年的田間觀察鑒定，對照品種為隴春23號，田間常規管理。記載主要農藝性狀并考種。

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進行數據統計分析。方差齊性檢驗用Duncan法檢測，非齊性檢驗用Tamhane’s T2法檢測[12]。

2 結果與分析

2.1 花藥培養

花藥培養結果(表1)表明，11份供試材料的愈傷組織誘導率在1.45%～37.28%之間，其中以隴春31號最高，且顯著高于其他材料，和尚頭最低；誘導率超過10%的有7份，其余4份材料均在5%以下。綠苗分化率在6.27%～66.21%之間，最高為引進的矮敗小麥，最低為和尚頭，綠苗分化率超過50%的有5份；20%～50%之間的有2份，其總體趨勢與愈傷組織誘導率基本一致。綠苗生產率在0.22%～21.11%之間，隴春31號最高，隴春29號則最低，超過10%的材料有3份材料，5%～10%之間的有3份。

在對矮敗小麥改良群體的花藥培養中，共接種約44 160枚，獲得愈傷組織2 628塊，愈傷組織誘導率為5.95%；獲得綠苗1 237個，綠苗分化率為47.07%，綠苗生產率為2.80%。經煉苗一周后于當年10月份移栽入溫室，成活866株，移栽成活率為70.01%；次年4月統計結實的株數為571株，即自發加倍率為65.94%，每株粒數在3～46粒之間。經田間種植篩選獲得115個株系。

表1 引進矮敗小麥群體及雜交父本的花藥培養Table 1 Anther culture of introduced dwarf-sterile population and the hybrid male parents %

同列數據后不同字母表示材料間存在顯著差異(P<0.05)。

Different letters following data in same column are significantly different among materials at 0.05 level.

2.2 麥谷蛋白亞基分子標記檢測

由表2可知，矮敗小麥含有Bx7、Dx5、Glu-A3ac、Glu-A3d基因；4份雜交父本材料含有5個優質麥谷蛋白亞基基因，分別為隴春29號、臨麥34號、定豐16號與和尚頭；供試的11份材料均含有Bx7，隴春27除外的其他10份材料均含有Dx5和Glu-A3d，而Bx14僅在臨麥34號中檢測到。

表2 引進矮敗小麥群體及雜交父本的麥谷蛋白亞基分子標記檢測Table 2 Molecular marker detection of glutenin subunits in introduced dwarf-sterile wheat population and the hybrid male parents

對所獲得的115個花培后代株系進行分子標記檢測的結果(表3)表明，Bx7的出現頻率最高，為94.78%，這與其在雜交親本中的頻率高相關；其余依次為Glu-A3ac、Dx5、Bx14、Glu-A3d、Glu-B3b；稀有亞基基因Bx14在41份材料中檢測到，頻率達到35.65%。

為明確所檢測的亞基基因在這些后代材料中的聚合情況，進一步對每份材料含有的優質亞基組合數進行了統計(表4)，發現含有3種亞基組合的材料數最多，為45(39.13%)份，其余依次為4(32，27.83%)種、2(25，21.74%)種、5(10，8.70%)種、6(2，1.74%)和1(1，0.87%)種亞基組合；聚合有4個及以上優質麥谷蛋白亞基基因的材料共計44份，占供試材料總數的38.26%。

表3 麥谷蛋白亞基基因在115個小麥花培后代株系的分布頻率Table 3 Frequency of glutenin subunit genes in 115 wheat anther-cultured plant lines

表4 麥谷蛋白亞基基因在115個花培后代株系的聚合Table 4 Composition of the determined glutenin subunit genes in 115 plant lines

2.3 小麥株系的田間農藝性狀鑒定篩選

對聚合有4個以上優質亞基的44份花培株系在田間進行了連續2年的農藝性狀鑒定，獲得農藝性狀優良的新品系3份(表5)，這3份新品系生育期與對照相當，株高較對照有所增高，與產量相關的穗粒數、千粒重及單株粒重均較對照增加。

表5 花培小麥新品系的農藝性狀及其含有的麥谷蛋白亞基基因Table 5 Agronomical traits and glutenin subunit genes of the anther-cultured new wheat lines

3 討 論

3.1 小麥花培親本選擇及其花培特性鑒定

篩選具有高花藥培養力的親本材料是花培育種者長期性和基礎性工作[13]。本研究對引進的矮敗小麥群體及10份雜交父本進行了花培特性鑒定，參照趙林姝等[14]方法評價了小麥基因型是否具有高花藥培養力(即愈傷組織誘導率≥12%、綠苗分化率≥21%、綠苗生產率≥8%)，發現隴春31號、寧春4號和200706均達到這一標準，隴春27號也接近這一標準，這與我們前期的研究結果基本一致[7,13]。對3份親本材料隴春29號、臨麥34號與和尚頭首次進行了花培特性的評價。引進的矮敗小麥群體由于存在眾多基因型，因此我們隨機采穗進行了花藥培養，總體其花培特性較好。按照花培親本搭配的基本原則[12, 15-16]，本研究所選取的親本中既含有花藥培養力較高的材料(寧春4號、隴春31號、隴春27號、200706)，又有品質優良的材料(甘春20號、和尚頭)，也有綜合農藝性狀優異的材料(隴春23號、隴春29號、臨麥34號、定豐16號)，因而有利于育種工作的進一步開展。

3.2 小麥麥谷蛋白亞基的分子標記

麥谷蛋白亞基與小麥品質密切相關[17-20]。早期主要通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)進行麥谷蛋白亞基檢測，然而SDS-PAGE法在兩個方面有所不足，一是需要以收獲的籽粒為原料，在時間上滯后于大田表型的鑒定篩選[21]；二是難以解決LMW-GS拷貝數高、與醇溶蛋白重疊的問題[22]。因此，以往大量的研究主要集中于HMW-GS的研究，然而LMW-GS約占全部麥谷蛋白的60%，決定面團的強度和粘度，對小麥的加工品質也起著相當重要的影響[1]。近年來HMW-GS和LMW-GS功能分子標記得到開發，為綜合利用HMW-GS與LMW-GS進行品質育種奠定了基礎[11, 23]。本研究采用已開發的3個HMW-GS和3個LMW-GS功能標記對雜交親本材料及花藥培養所獲得的115個株系進行了檢測，明確了隴春23號、臨麥34號及和尚頭等品種攜帶的部分亞基信息，同時獲得了聚合有4個亞基以上的花培后代株系44份，通過農藝性狀鑒定，篩選出了3份聚合4種以上優質亞基的新品系。進一步還需要對這3份材料進行多年多點的產量鑒定及品質檢測，為HMW-GS與LMW-GS分子標記在小麥育種實踐的應用提供支持。

3.3 高效育種技術體系的建立

自1970年代初開始，人們從事小麥花培育種研究已近半個世紀之久，國內外相關研究者通過不斷優化花藥培養技術體系，相繼育成品種50多個，目前已成為小麥常規育種的重要補充[3, 24]。而與傳統常規育種相比，花培品種偏少，花培育種技術所具有的縮短育種時間和提高育種效率的優勢未能得到充分體現，這與人們最初對其期待有一定距離。分析個中緣由，主要與小麥花藥培養的基因依賴性強、培養效率低，以及與其他育種技術結合不夠密切相關[3]。因此，除了繼續從影響花藥培養的關鍵因子入手以提高花藥培養效率之外，還需探索該技術與其他技術結合的可行性，擴大該技術應用的廣度和深度，才能更好地發揮花藥培養的優勢[25]。近年來，矮敗小麥育種技術在小麥新品種選育中獲得巨大成功，而目前快速發展的分子標記輔助選擇技術可有效克服傳統常規育種中選擇的盲目性。本研究將花培育種技術、矮敗小麥育種技術與分子標記輔助選擇技術進行有機結合，獲得了3份農藝性狀優良且至少聚合4種以上優質亞基的新品系，經進一步培育有望育成新品種在生產上應用，這為建立以“矮敗小麥+花藥培養+分子標記”三者有機結合的小麥高效育種技術體系提供了參考依據。