賀 燕，唐小蘭，何 娟，王亮亮，肖 穩，王曉慶

（湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南長沙 410007）

蠶豆醬，也稱為豆瓣醬，是湖南岳陽地區家庭制作和食品企業生產的主要醬類產品，以去皮蠶豆為主要原料，經蒸煮、自然接種或人工純種接種，發酵后拌以食鹽等其他調味料，經調配之后形成的色香味俱全的調味品。永豐辣醬是湖南雙峰特產，以小麥為主要原料，通過自然接種制作曲醅，經發酵、曬干、磨碎，再配以辣椒、食鹽、水等經曬制而成。該產品氣味芳香、味道極鮮，含有豐富的蛋白質及各種微量元素，并且具有促進新陳代謝之功效[1]。蠶豆醬和永豐辣醬都屬于湖南人民餐桌上的上好調味品，但美中不足的是產品易發生黃曲霉毒素B1超標、胖聽等質量安全問題。其原因為國內發酵豆制品的生產模式以小作坊為主，發酵過程在開放的環境下進行。另外，因原料在收貨和貯存過程中受外界環境的影響，產生黃曲霉毒素和污染其他微生物，導致胖聽和變質現象[2]。試驗擬以傳統蠶豆醬和永豐辣醬的曲胚、發酵半成品、成品等為對象，研究這2類特色醬類中的主要微生物，旨在從微生物的角度來尋求一條防控黃曲霉毒素B1超標的途徑，為企業提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 樣品、培養基與試劑

1.1.1 樣品來源

蠶豆醬，岳陽市川康醬品有限公司、湖南省十三村食品有限公司、岳陽臨湘華一食品公司提供。

永豐辣醬，湖南湘軍永豐辣醬有限公司、湖南曾府辣醬有限公司、雙峰豐新農業公司提供。

選取6個公司的原料、曲種，發酵半成品、發酵成品等25個樣品。

1.1.2 培養基、染色液及試劑

察氏培養基、PDA培養基、孟加拉紅培養基、PCA培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基（VRBA培養基）、棉蘭乳酚染色液、革蘭氏染色液；甲醇（色譜純），上海安譜有限公司提供；甲酸（AR），上海國藥有限公司提供。

1.1.3 霉菌種

標準米曲霉菌種CICC2358、標準總狀毛霉菌種CICC40531，中國菌種保存中心提供。

1.2 儀器與設備

MIR-254型生化培養箱、VITEK2型細菌鑒定儀、80i型尼康顯微鏡、AB/SCIEX QTRAP 4500型液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 蠶豆醬和永豐辣醬的優勢微生物分析

（1）采樣中優勢微生物的分離、純化、計數。優勢微生物的研究擬采用稀釋平板分離計數法[3]。霉菌和酵母分離采用PDA和察氏培養基、孟加拉紅培養基，大腸菌群采用結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基，細菌采用營養瓊脂培養基。試驗中樣品因有原料、曲胚、發酵半成品和成品，考慮到每種樣品含有的微生物不同，實際操作中宜進行較高稀釋度的稀釋，特別是曲胚。

霉菌的分離和純化采用玻片插入培養方法。

（2）微生物的分類鑒定。根據霉菌培養的菌落特點及鏡檢孢子的微觀結構，并結合《真菌鑒定手冊》[4]，對醬類產品中的霉菌進行分類鑒定。細菌經純化之后采用VITEKⅡ型細菌鑒定儀進行鑒定。

1.3.2 黃曲霉毒素B1測定

按照GB 5009.22—2016食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定。

2 結果與分析

2.1 微生物體系的組成分析

分別對蠶豆醬和永豐辣醬的醬胚、半成品和成品進行分離計數后，按培養基和菌落特征進行歸類，初步確定了兩大類醬類微生物體系的組成，以利于產品質量控制的研究。

對蠶豆醬、永豐辣醬的醬胚、半成品和成品進行了不同培養基的分離培養后。

蠶豆醬不同發酵階段微生物的組成見表1，永豐辣醬不同發酵階段微生物的組成見表2。

表1 蠶豆醬不同發酵階段微生物的組成

表2 永豐辣醬不同發酵階段微生物的組成

結果發現，蠶豆醬發酵過程中主要微生物體系組成為霉菌、細菌和酵母。由于采用了不同廠家的樣品，但主要微生物體系組成的結論一致，3種微生物的構成比例在不同的發酵階段不同，出現了消長的現象。不同廠家的醬類產品微生物不同發酵階段組成大同小異，源于相似的制曲工藝、發酵工藝、原料，因廠家生產環境、人員操作的差異而導致了個體在數量上的微小變化。醬類產品在不同階段出現霉菌、細菌、酵母消長的現象。第一階段是霉菌迅速繁殖階段。經人工純種接種或自然接種的前期制曲胚階段，接種的主要微生物是霉菌，并且培養的環境一般為28~30℃，此階段霉菌占絕對優勢，并分泌各種的酶，如糖化酶、蛋白酶等，為后期的入池發酵準備條件。第二階段是細菌和酵母迅速繁殖階段。在這個階段，工藝中一般添加了食鹽進行發酵，較高濃度的食鹽和氧氣的缺乏，霉菌的生長受到抑制，細菌和酵母有所增長[5]。第三階段是微生物生長受抑制階段。由于代謝產物的積累，微生物生長基本停止。從生產工藝來看，根據傳統的蠶豆醬和永豐辣醬制作工藝，有高溫曬制工藝，永豐辣醬的小麥曲有洗曲過程，這也是影響微生物體系組成的因素，特別是霉菌，在成品普遍檢出率不高。

2.2 微生物的鑒定

2.2.1 優勢霉菌的鑒定[4，6]

分別選擇了PDA、馬鈴薯蔗糖培養基、孟加拉紅培養基、察氏培養基，發現霉菌在PDA、孟加拉紅培養基、察氏培養基上生長較為好，從霉菌生長的速度和菌落特征來看PDA和察氏培養基相當，孟加拉紅可能因加入了抗生素，菌落個頭和數量較PDA和察氏培養基要小，這和有關培養基對酵母和霉菌檢測結果影響研究的結論一致[7]。

（1）永豐辣醬中優勢霉菌菌落生長形態及顯微形態特征。

永豐辣醬在PDA和孟加拉紅培養基上分離得到的霉菌見圖1，經純化后的A菌落特征見圖2，菌落A顯微特征圖譜見圖3，經純化后的B菌落特征見圖4，B菌落顯微鏡特征圖譜見圖5，標準米曲霉菌落形態及顯微特征圖譜見圖6。

圖1 永豐辣醬在PDA和孟加拉紅培養基上分離得到的霉菌

圖2 經純化后的A菌落特征

圖3 菌落A顯微特征圖譜

圖4 經純化后的B菌落特征

圖5 B菌落顯微鏡特征圖譜

圖6 標準米曲霉菌落形態及顯微特征圖譜

永豐辣醬經孟加拉紅和PDA培養基進行分離后主要得到2種優勢霉菌（如圖1，圖2），經純化分離后得到2種菌，即A，B，其特征分別描述為：①A菌落呈純白色厚絨狀的大菌落，生長迅速，3 d后可布滿整個培養皿孢子呈黑色（圖2），肉眼可以看到菌絲上面分布著黑色孢子，發展成熟后，整個菌落呈深褐色，頂部基本上為黑色。其顯微鏡特征（圖3）：菌絲呈無色透明狀，無橫隔，孢子囊呈球形，分生孢子自頂囊全面著生，像菊花狀，表面略顯粗糙。參照齊組同編寫的《中國真菌志》第5卷曲霉屬及其相關有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的黑曲霉。②B菌落2 d后長成直徑為1.5~2.0 cm的白色菌落，3 d后菌落中間出現黃色小點，4 d后外圈有白色菌絲，中層為黃色，內圈凸起且因有孢子原因呈現為黃綠色孢子，隨著進一步的培養，孢子布滿整個菌絲上面，出現黃綠或藍綠色的菌落，如圖4菌落形態。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗較長，菌絲無色透明，頂囊粗大，近似橢圓形，小梗著生于頂囊上半部，分生孢子呈串著生在小梗的頂端（如圖5），根據標準米曲霉菌落形態及顯微特征（如圖6），同時參照齊組同編寫的《中國真菌志》第5卷曲霉屬及其相關有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的米曲霉[8]。

永豐辣醬主要采用傳統的自然發酵，從分離和鑒定得到的霉菌菌系來看，主要是以黑曲霉和米曲霉為主。另因生產是開放的環境下進行，對生產過程中微生物的污染不能有效控制，在抽檢的企業中存在個別其他霉，如青霉、黃曲霉菌，因而安全性會存在一定的問題。黑曲霉具有產纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶系功能[9]。米曲霉是一類產復合酶的菌株，除產蛋白酶外，還可產淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。永豐辣醬的原料主要為小麥、糯米等，這就需要產淀粉酶、蛋白酶、糖化酶能力強的霉菌來分解原料。辣醬前期制曲階段的霉菌菌相的組成，特別是有益曲霉屬的存在，成為直接決定辣醬產品發酵成功的關鍵。

（2）蠶豆醬中優勢霉菌的菌落生長形態及顯微形態特征。

蠶豆醬中不同培養時間的霉菌菌落特征見圖7，蠶豆醬主要霉菌顯微特征見圖8。

圖7 蠶豆醬中不同培養時間的霉菌菌落特征

圖8 蠶豆醬主要霉菌顯微特征

從湖南省岳陽地區抽取的3家企業10多個樣品中，經多種真菌培養基上分離主要得到一種霉菌：在PDA上首先生長為純白色，隨后菌落中間出現黃色小點，接著黃色孢子增多并逐漸轉變為黃綠色孢子，隨著進一步的培養，孢子布滿整個菌絲上面，出現黃綠色菌落，如圖7菌落形態。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗較長，菌絲無色透明，頂囊粗大，近似橢圓形，小梗著生于頂囊上半部，分生孢子呈串著生在小梗的頂端（如圖8），根據標準米曲霉菌落形態及顯微特征（如圖6），同時參照齊組同編寫的《中國真菌志》第5卷曲霉屬及其相關有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的米曲霉[8]。

蠶豆醬分自然發酵的方法和純種接種發酵，自然發酵是指制曲的過程是在開放式條件下進行。有研究表明，霉菌是在發酵過程中起主要作用的一類微生物，從醬曲中分離所得到的霉菌有黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉、高大曲霉等[10]。為便于穩定產品質量，目前有很多廠家使用發酵劑純種進行發酵。試驗從抽取的3家企業從原料、發酵半成品、發酵成品分離的結果來看，分離得到的優勢霉菌菌種為米曲霉，但也有個別企業的產品出現了其他霉菌，經鑒定為黃曲霉菌。

2.2.2 引起永豐辣醬脹包現象的優勢細菌的鑒定

永豐辣醬主要采用的是傳統自然發酵，在開放的環境下，易受到外界環境中微生物的污染，易產生脹包、變色等現象。針對企業提出的成品醬易出現脹包現象，試驗對部分成品醬按照GB 4789的方法進行了大腸菌群、細菌、霉菌和酵母的檢測，結果發現大腸菌群和霉菌酵母均未檢出，菌落總數達到了108數量級。從菌落形態來看，存在著幾種優勢菌，對優勢菌進行分離純化，經革蘭氏染色后上VITEK2進行生化鑒定，確定引起辣醬脹包現象的主要優勢細菌為耶爾氏菌、甲基桿菌屬、魯沃夫不動桿菌。

2.2.3 永豐辣醬中黃曲霉毒素B1含量

從3家不同的企業中抽取原料、半成品、成品進行黃曲霉毒素B1的檢測。

永豐辣醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1的含量見表3。

表3 永豐辣醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1的含量

永豐辣醬通常采用傳統的自然發酵，工藝路線基本相同，但是3個不同的企業卻出現截然不同的結果，特別是湖南C辣醬有限公司，抽取的3個醬都已超過國標的限量要求5.0 μg/kg[11]，最高者達到了13.97 μg/kg。黃曲霉毒素是真菌毒素的一種，主要由黃曲霉和寄生曲霉2種真菌菌株產生，此外還有曲霉、青霉、根霉等。黃曲霉毒素是強致癌物質,是毒性極強的劇毒物質[12]，毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍[13]。因而安全問題需引起高度重視。追溯到對湖南C辣醬有限公司成品醬的微生物特別是霉菌分析發現，此3個樣品除了有優勢霉菌——米曲霉和黑曲霉之外，因為露天發酵，還存在著其他的雜霉——經鑒定為黃曲霉菌。黃曲霉菌廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實上，辣醬在發酵過程中，要注意加工場所的環境條件，控制好發酵工作間的溫度和濕度，防止滋生其他雜菌，從來引起質量安全問題。

2.2.4 蠶豆醬中黃曲霉毒素B1的含量

從3家不同的企業中抽取原料、半成品、成品，進行黃曲霉毒素B1的檢測。蠶豆醬主要采用的純種醬曲發酵，所以上文對蠶豆醬的霉菌分析主要為米曲霉且菌種比較單一。但個別廠家因生產環境差，特別是曲房多年未進行清理，導致發酵過程中其他霉菌的滋生，從而影響產品的品質。

蠶豆醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1含量見表4。

表4 蠶豆醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1含量

從表4中的結果來看，3家企業中岳陽市E醬品有限公司的發酵中間品黃曲霉毒素B1出現嚴重超標現象，高者達到30.03 μg/kg。分析其原因，產品中霉菌種類除了優勢菌米曲霉之外，還有黃曲霉菌，其中黃曲霉菌是產生黃曲霉毒素B1的一個來源。對于該企業，致使滋生黃曲霉菌的主要原因是曲房和生產環境條件惡劣，其次原料品質、發酵工藝條件也能影響到黃曲霉毒素產生，已有研究[14]發現，發酵溫度為30℃和32℃時黃曲霉毒素值最小。

3 結論

（1）通過對6個醬類生產企業從原料、曲胚、醬胚、半成品、成品的微生物分析，得出醬類產品不同發酵階段霉菌、酵母、細菌出現消長的現象，這與發酵過程中不同階段的主要任務和代謝產物有關。

（2）根據霉菌菌落形態及顯微特征并結合有關霉菌鑒定書籍，對永豐辣醬和蠶豆醬中的主要霉菌進行了鑒定，確定了永豐辣醬中主要的優勢霉菌為米曲霉和黑曲霉，蠶豆醬中主要的優勢菌為米曲霉。通過分析醬產品中主要優勢霉菌，為企業控制好產品質量提供了菌種知識的理論指導。

（3）利用VITEK2對易引起辣醬產品脹包現象的細菌進行鑒定，并確定引起辣醬脹包現象的主要優勢細菌為耶爾氏菌、甲基桿菌屬、魯沃夫不動桿菌。下一步應對此3類菌進行生理生化研究，并對其進行防腐條件的探索，有望解決醬制品中易出現脹包的質量問題。

（4）從醬類企業的原料、半成品和成品的黃曲霉毒素B1的監測結果發現，黃曲霉毒素B1嚴重超標的問題主要是發酵過程中滋生了黃曲霉菌。醬料生產企業應注意曲房等環境條件，在制曲和發酵過程中控制好溫度和濕度，促進優勢霉菌的生長，防止其他雜菌的滋生，同時嚴把原料關，以防止黃曲霉毒素的污染。此外，國內外在進行黃曲霉毒素的防控方面有物理、化學、生物技術進行脫毒處理研究[15]。下一步，若能將這些研究將應用到醬類產品中黃曲霉毒素B1的脫毒處理上，將會極大地推動醬類產品的發展。