響應面法制備小球藻多肽-鈣螯合物的制備工藝

花朋朋，熊 煜，于志穎，劉 斌，，趙立娜

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350002；2.國家菌草工程技術研究中心，福建福州 350002）

小球藻（Chlorella pacifica）是一種單細胞綠藻，屬于綠藻門 （Chlorophyra）、綠藻綱 （Chlorophyceae）、小球藻屬（Chlorella），具有生長繁殖迅速等特點。小球藻富蛋白質[1]，營養價值高，易于被人體吸收，包含8種人體必需氨基酸，完全能滿足人、動物的生長所需，具有很高的應用價值[2-4]。目前，國內外的研究熱點是藻類蛋白活性肽，大部分研究主要集中在開發藻類多肽的抗氧化、抗菌、降壓、降脂、預防骨質疏松等生物活性免疫調節等功能性生物活性肽[5]，然而對小球藻鈣螯合肽活性的研究卻不常見。

鈣在人體機能中扮演著重要功能作用，當機體攝入鈣不足會造成佝僂病、軟骨病、骨質疏松等各種疾病，同時會對人類的生命健康造成重大的危害[6。目前市場上鈣補充制劑很多，主要有無機鈣、有機鈣[7]。然而，眾多補鈣產品的生產及銷售并未能從根本上改變人們的缺鈣問題，其原因在于一方面人體對鈣的攝入不夠，另外一方面就是人體機能內部對鈣的有效吸收率低[8]，隨之而來又有一個弊端，雖然一些有機鈣制劑能夠可以大量被機體吸收，但會伴隨負反饋調節系統失調，反而抑制鈣的吸收。目前，已發現多肽具有礦質載體的作用，可與金屬離子螯合形成多肽-鈣復合物，進而促進小腸對鈣的吸收，如牛乳酪蛋白磷酸肽[9]、蛋黃肽、大豆蛋白肽、魚鱗及魚骨肽[10-18]。但這些多肽制備價格昂貴，因此小球藻多肽螯合鈣以其生物效價高、易吸收、無毒、無刺激作用等優點[19]成為了為第4代補鈣制劑，得到了人們的青睞。

試驗以小球藻為原料，通過中性蛋白酶酶解法，來制備小球藻多肽，并將其與Ca2+進行螯合，目的在研發具有螯合率較高的小球藻多肽-鈣螯合物。利用單因素試驗探究了螯合時間、螯合溫度、螯合肽鈣質量比、螯合底物質量分數和pH值對螯合率的影響。并通過響應面試驗優化制備工藝，制得了較高品質的小球藻多肽-鈣螯合物。該研究可充分發揮多肽和礦物質元素對人體的雙重營養功能特性，為小球藻應用開發提供了一種新的開拓思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻，臺灣綠藻工業股份有限公司提供；中性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供；EDTA、氫氧化鉀（KOH）、三乙醇胺、鈣指示劑、CaCl2、鈣羧酸指示劑、無水乙醇和氫氧化鈉（NaOH）等，均為分析純；去離子水，實驗室自制。

1.2 儀器與設備

TDL-5-A型低速離心機，湖南凱達科學儀器有限公司產品；FE20型精密pH計、ZD-2型雷磁電位自動滴定儀，上海儀電科學儀器股份有限公司產品；FD-3型冷凍干燥機，河北國輝實驗儀器有限公司產品；電子分析天平，上海化科實驗器材有限公司產品；SHA.B型精達水浴恒溫振蕩器，常州精達儀器制造有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 小球藻多肽的制備流程[20]

小球藻→去離子水溶解（料液比1∶30）→添加NaOH（溶液質量分數為4%）→在50℃下水浴1 h→6層紗布過濾→離心（5 000 r/min，10 min） →取上清液→調pH值3（30 min） →離心（5 000 r/min，10 min）→沉淀冷凍干燥→小球藻蛋白→去離子水溶解（料液比1∶30）→調整pH值7.5→中性蛋白酶酶解（40℃）→40℃水浴6 h→沸水浴滅酶（10 min）→離心（4 500 r/min，10 min） →上清液（小球藻多肽溶液）→冷凍干燥→小球藻多肽。

1.3.2 小球藻多肽-鈣螯合物的制備

稱取一定量小球藻多肽復溶成一定濃度的多肽溶液，加入1 mol/L NaOH調整pH值為9.0，按一定質量比加入鈣離子（以無水氯化鈣的形式），將其放置于一定溫度的水浴搖床中充分反應一段時間，反應后置于室溫冷卻，以轉速4 500 r/min離心10 min取上清液，加入5倍體積的95%乙醇溶液，靜置沉淀12 h，以轉速4 500 r/min離心10 min取沉淀，用無水乙醇對沉淀物洗滌數次，將其置于烘箱中進行低溫干燥處理，使無水乙醇揮發，然后進行凍干獲得多肽-鈣螯合物粉末。

1.3.3 測定總鈣含量的測定[21]

反應液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），依此將2~3 mL三乙醇胺、0.8~1.0 mL氫氧化鉀溶液、適量鈣指示劑加入，搖勻，接著用EDTA溶液滴定，溶液從紫紅色變成純藍色為終點，記錄EDTA體積V0。根據公式計算可得總鈣含量M0。

1.3.4 螯合鈣含量的測定

反應液與去離子水以0.1∶50（mL∶mL），量筒量入20 mL的乙醇，恒溫條件下振搖1 h，以轉速3 500 r/min離心10 min，去除上清液，蒸餾水定容20 mL，吸取2 mL此溶液，同1.3.3步驟（EDTA滴定），記錄EDTA體積V1。根據公式計算可得螯合鈣含量 M1。

1.3.5 鈣螯合率的測定

式中：M0——反應液中總鈣含量，g；

M1——表示同體積反應液中螯合鈣的鈣含量，g。

1.3.6 螯合條件單因素試驗

（1）螯合時間對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質量分數3%，調整pH值為8，肽鈣質量比1∶2水浴搖床溫度設置40℃，螯合時間分別為 20，30，40，50，60，70，80 min，測 3 次螯合率。

（2）螯合溫度對鈣螯合率的影響。取小球藻多肽2 g，底物質量分數3%，調整pH值為8，肽鈣質量比1∶2，水浴搖床溫度分別設置30，40，50，60，70，80℃，螯合時間50 min，測3次螯合率.

（3）肽鈣質量比對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質量分數3%，調整pH值為8，肽鈣質量比分別為 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

（4）底物質量分數對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質量分數2%，3%，4%，5%，6%，7%，調整pH值為8，肽鈣質量比3∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

（5）pH值對鈣螯合率的影響。稱取小球藻多肽2 g，底物質量分數3%，調整pH值分別為5，6，7，8，9，10，11，12，肽鈣質量比3∶1，水浴搖床溫度設置50℃，螯合時間50 min，測3次螯合率。

1.3.7 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，以鈣螯合率為指標，選取4個對鈣螯合率影響最顯著的因素（螯合溫度、肽鈣質量比、底物質量分數、pH值），采用Box-Behnken組合方法進行四因素三水平響應面試驗設計，同時運用Design Expert 8.1軟件設計試驗對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 螯合時間對鈣螯合率的影響

螯合時間對鈣螯合率的影響見圖1。

圖1 螯合時間對鈣螯合率的影響

由圖1可知，鈣螯合時間在20~50 min時，鈣螯合率隨螯合時間的延長而升高；當螯合時間在50 min時，鈣螯合率最高，達到79%±0.02%；但是，當螯合時間大于50 min時，鈣螯合率開始下降。此現象說明螯合時間過長，很容易造成鈣螯合物結構的不穩定，反而不利于鈣螯合物的發生[22-23]。此結果表明螯合時間對鈣螯合率沒有顯著性差異，說明鈣螯合反應迅速，螯合時間對螯合率的影響較小[24]。所以在后續的螯合試驗中，選擇螯合時間為50 min。

2.1.2 螯合溫度對鈣螯合率的影響

螯合溫度對鈣螯合率的影響見圖2。

圖2 螯合溫度對鈣螯合率的影響

由圖2可知，鈣螯合溫度在30~60℃時，鈣螯合率快速增加；在60℃時，鈣螯合率最高，達到85%±0.01%；當螯合溫度大于60℃時，鈣螯合率開始下降，原因在于一方面溫度過高會使氨基酸或者小肽發生羰氨反應，與鈣離子形成競爭，導致鈣螯合率降低，另一方面溫度過低會使螯合反應速率變慢[25-27]。因此螯合溫度定位60℃，進行后續響應面優化試驗。

2.1.3 肽鈣質量比對鈣螯合率的影響

多肽與氯化鈣質量比對鈣螯合率的影響見圖3。

圖3 多肽與氯化鈣質量比對螯合率的影響

由圖3所示，當小球藻多肽與鈣質量比為3∶1時，鈣螯合率最大為87%±0.02%，繼續增大氯化鈣質量，鈣螯合率開始下降；當氯化鈣的添加量較小，多肽過量時，使得部分多肽無法與鈣離子形成穩定結構，造成了活性多肽的浪費，當Ca2+含量過高時，多肽中的鈣螯合位點達到飽和狀態，導致大多數鈣以游離態的形式出現在反應體系中，最終導致鈣螯合率的較低[28]。最終選擇肽鈣質量比為3∶1，進行后續響應面的優化。

2.1.4 底物質量分數對鈣螯合率的影響

底物質量分數對鈣螯合率的影響見圖4。

圖4 底物質量分數對鈣螯合率的影響

由圖4可知，在底物質量分數為5%時，鈣螯合率最大為90%±0.01%，再增加多肽質量濃度鈣螯合率反而下降。這可能是因為當多肽濃度較大時，會造成反應體系的黏度系數，減小了二者的接觸面積和幾率，不利于螯合反應的進行，降低了鈣螯合率。最終，選擇底物質量分數5%進行后續響應面試驗。

2.1.5 pH值對鈣螯合率的影響

pH值對鈣螯合率的影響見圖5。

圖5 pH值對鈣螯合率的影響

由圖5可知，當螯合液在酸性條件下時，鈣螯合率較低。這可能是由于H+與Ca2+二者發生對供電子基團的競爭[29]，對小球藻多肽-鈣螯合物的生成造成了阻礙。當螯合液pH值在5.0~9.0時，隨著pH值的不斷升高，鈣螯合能力快速升高，在pH值9.0時，鈣螯合率最大為96%±0.01%；但pH值超過9.0時，鈣含量反而下降，此時可能因為在強堿條件下容易發生了一系列的副反應，導致鈣螯合率較低[30]。因此選擇pH值為9.0，進行后續響應面優化試驗。

2.2 螯合條件響應面試驗結果

2.2.1 數學模型的建立及顯著性檢驗

響應面試驗設計和結果見表1。

表1 響應面試驗設計和結果

如表1所示，以鈣螯合率作為響應值，運用Design Expert回歸分析軟件分析表1中29個試驗點的響應值，綜合數據分析，各試驗單因素對鈣螯合率的影響，得出如下回歸方程：

響應面二次模型方差分析見表2。

表2 響應面二次模型方差分析

其回歸方程達到了極顯著水平（p<0.01），且失擬項不顯著（p>0.05），表明此建模成功。總決定系數R2=0.945 3，表明該方程是高度顯著的，即該模型預測值與實際試驗值擬合較好。由表2可知，D，AD，CD，BC，B2，C2，D2項都對鈣螯合率有顯著的影響，順序為pH值>肽鈣質量比>底物質量分數>螯合溫度。從響應面分析圖可以直觀地看到2個因素間的交互作用對鈣螯合率的影響大小，螯合溫度、肽鈣質量比、底物質量分數、pH值4個因素之間交互作用對鈣螯合率的影響。

如表2和圖6所示，對鈣螯合率影響最顯著的交互作用是底物質量分數和pH值，其次是螯合溫度和pH值，而肽鈣質量比和pH值之間的交互作用，對響應值沒有顯著差異。

2.2.2 響應面試驗分析及對小球藻多肽鈣-螯合物制備的優化

通過Design Expert軟件綜合分析得出的回歸方程，讓各因素保持不變，只對回歸模型進行適宜的緯度調整，從而考查各因素間的交互作用對小球藻多肽-鈣螯合物鈣螯合率的影響。通過對回歸分析結果進行分析，作出響應面和等高線圖。

如圖6所示，等高線圖呈現橢圓形，說明二者交互作用顯著，同時相應面圖出現最高點，鈣螯合率值最大[31]。試驗表明，底物質量分數和pH值之間、pH值和螯合時間之間存在著較顯著的交互作用。

交互作用對鈣螯合率影響的響應面圖見圖6。

圖6 交互作用對鈣螯合率影響的響應面圖

利用Design Expert軟件由所建的數學模型進行參數最優分析，得出小球藻多肽-鈣螯合物的鈣螯合率最高參數條件為螯合溫度54.05℃，肽鈣質量比3.13，底物質量分數4.75%，pH值9.02，螯合時間50 min，鈣含量的預測值為96.14%，為適合操作，調整條件螯合溫度75℃，pH值9，肽鈣質量比2∶1，底物質量分數5%，螯合時間60 min，做3組平行試驗。對試驗進行驗證，得結果表明在此條件下螯合率為97.15%±0.001 225%，與預測值無顯著性差異（p>0.05）。證明此條件為小球藻多肽鈣螯合反應的最優條件，該回歸方程可應用于實踐。

3 結論

由響應面分析法優化小球藻多肽與鈣螯合的最佳工藝條件為螯合溫度50℃，pH值9，肽鈣質量比3∶1，底物質量分數5%，螯合時間60 min，在此條件下制備的螯合物的鈣螯合率為97.15%±0.001 225%，與預測值96.14%沒有顯著性差異。小球藻多肽和鈣離子發生螯合反應，生成了一種新型多肽-鈣螯合物，為合成新型補鈣制劑的開發與利用提供了理論依據，同時也為小球藻的開發利用提供了一個新的研究思路。