美味牛肝菌蛋白質的超聲波輔助提取工藝及功能性質研究

郭 磊，張紹英，劉家奇，何加鮮，闞 歡，劉 云

（西南林業大學輕工與食品工程學院，云南昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.Fr.）是世界著名的野生菌，在歐洲被稱為“王者牛肝菌”[1]，是一種在世界范圍內分布的食藥兼用、經濟價值較高的真菌，我國各省區均有分布，尤其西南地區產量較高[2]，且全世界已知的牛肝菌屬已有1 024種，我國已知的可食用的就有199種[3]。云南美味牛肝菌含有豐富的蛋白質、粗纖維、多種氨基酸，以及豐富的磷、鉀、鈣、鎂、鐵和鋅等人體必需礦物質元素[4]，多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐、婦女白帶異常等癥[5]，具有很高的食用價值和藥用價值。

傳統的蛋白質提取方法有堿溶酸沉法、酶法、非蛋白質法、復合法等[6-8]，而堿溶酸沉法具有簡單易行、成本低、提取率高、純度較高等優點。超聲波技術能夠使細胞中的可溶性成分與溶劑分子更好地接觸，從而使可溶性成分更好地釋放出來[9-10]，是近些年發展的一種高效物理提取技術，在食品加工業中應用廣泛[11-14]。

目前，美味牛肝菌的研究主要集中加工和活性成分的提取等方面，對美味牛肝菌蛋白質的提取及功能性質研究方面未見報道。試驗采用超聲波輔助堿法提取云南美味牛肝菌蛋白質，初步探討其功能特性，以期為增加美味牛肝菌的附加值、蛋白質工業生產和開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南美味牛肝菌，云南易門縣康源菌業有限公司提供；標準牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250，上海勵瑞生物技術有限公司提供；氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸、鹽酸、氯化鈉，以上均為分析純；食用油，市售。

FA1004型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品；DHG-9240A型鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司產品；JSP-200型多功能粉碎機，浙江永康金穗機械制造廠產品；L550型臺式低速離心機，湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司產品；723C型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；BC/BD-213H型臥式轉換型冷凍箱，河南新飛電器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛血清蛋白標曲的繪制

參照趙玉紅等人[15]采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量，繪制牛血清蛋白的標準曲線。

1.2.2 蛋白質得率

美味牛肝菌經干燥、粉碎過篩后提取蛋白質，離心分離得上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質含量，蛋白質得率計算公式如下：

1.2.3 美味牛肝菌蛋白質的提取工藝及優化

以蛋白質得率為指標，研究料液比、提取溫度、超聲波功率、氫氧化鈉溶液質量濃度、提取時間等因素對美味牛肝菌蛋白質提取效果的影響。蛋白質提取的因素設置為以下水平：固定提取溫度65℃，超聲波功率300W，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，提取時間1.5 h，考查不同的料液比1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80對蛋白質得率的影響；固定料液比1∶60，超聲波功率300 W，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，提取時間1.5 h，考查不同提取溫度45，55，65，75，85℃對蛋白質得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，提取時間 1.5 h，考查不同超聲波功率250，300，350，400，450 W對蛋白質得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，超聲波功率400 W，提取時間1.5 h，考查不同氫氧化鈉溶液質量濃度5，6，7，8，9 mg/mL對蛋白質得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，超聲波功率400 W，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，考查不同提取時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h對蛋白質得率的影響。

在單因素的基礎上，選擇對美味牛肝菌蛋白質得率影響較大的料液比、提取溫度、超聲波功率、提取時間為考查因素，采用四因素三水平正交試驗進行優化獲得云南美味牛肝菌蛋白質的最佳提取工藝條件。

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

1.2.4 美味牛肝菌蛋白質的功能性質

（1）美味牛肝菌蛋白質的制備。利用蛋白質在pH值=pI時發生蛋白質析出的方法得到蛋白質沉淀。按照最佳條件將蛋白質提取液的pH值準確調至4.5并靜置2 h后，再經高速離心機以轉速4 000 r/min離心30 min，干燥后用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量為65.7%。

（2）溶解性。①溫度對蛋白質溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]的方法并略作調整，將1%的蛋白質溶液分別在30，40，50，60，70，80，90℃下水浴加熱1 h后快速冷卻至室溫，以轉速4 000 r/min離心30 min，取上清液用紫外可見分光光度計于波長595 nm處測定吸光度。②pH值對蛋白質溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]的方法并略作調整，用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節1%的蛋白質溶液，使其pH值分別為2，3，4，5，6，7，8，9，于室溫下攪拌1 h后以轉速4 000 r/min離心30 min，取其上清液于波長595 nm處測定吸光度。③離子強度對蛋白質溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]方法并略作調整，將1%蛋白質溶液各1 mL置于質量分數分別為1%，2%，3%，4%，5%的NaCl溶液中，然后調節pH值梯度依次為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，于室溫下攪拌1 h后以轉速4 000 r/min離心30 min，取其上清液于波長595 nm處測定吸光度，同時以不加蛋白質的溶液為空白。

（3）持水性。參照Lqari H等人[17]方法并略作調整，稱取1 g美味牛肝菌蛋白質置于離心管中與去離子水混合均勻，靜置10 min后以轉速4 000 r/min離心20 min，除上層液體后稱質量，按公式（2）計算持水性（WHO），以大豆分離蛋白為對照。

式中：W1——分離蛋白質質量，g；

W2——離心管質量，g；

W3——離心管和持水后樣品質量，g。（4）起泡性及泡沫穩定性。參照Lawhon J等人[18]方法并略作調整，取1%蛋白質溶液50 mL以轉速8 000 r/min攪拌1 min后測定泡沫體積V0。靜置120 min后測量泡沫的體積V120，經公式（3）、（4）計算起泡能力（FC）和泡沫穩定性（FS），以大豆分離蛋白為對照。

（5）持油性。參照Fuhrmeister H等人方法并略作調整，取1 g蛋白質與10 mL大豆油放入離心管中并振蕩混勻后，以轉速4 000 r/min離心20 min除去游離的油脂，再次稱質量，按公式（5）計算持油性（FBC），以大豆分離蛋白為對照。

式中：W1——離心管和蛋白質質量，g；

W2——蛋白質、油脂和離心管質量，g；

W0——蛋白質質量，g。

2 結果與分析

2.1 牛血清蛋白標曲的繪制

于波長595 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、牛血清蛋白標準液質量濃度為橫坐標，得出標準曲線及回歸方程Y=0.752 9X+0.005 9，R2=0.997 4，線性范圍在0~0.1 mg/mL。

牛血清蛋白標準曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對蛋白質得率的影響

料液比對蛋白質得率的影響見圖2。

由圖2可知，美味牛肝菌蛋白質的得率隨著料液比的升高呈現先增大后減小的變化趨勢。在料液比為1∶60（g∶mL）時，得率達到最大，為15.390%。這是由于隨著料液比的增大，體系的黏度降低，傳質過程加快，因而得率提高，綜合考慮最適料液比為 1∶60。

圖2 料液比對蛋白質得率的影響

2.2.2 提取溫度對蛋白質得率的影響

提取溫度對蛋白質得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對蛋白質得率的影響

由圖3可知，美味牛肝菌蛋白質得率隨提取溫度的升高呈先增后減的趨勢，并在提取溫度為65℃時達到最大，為15.326%。這是因為前期溫度的升高有利于蛋白質的溶解，同時超聲波的作用加速了蛋白質的溶出；但提取溫度過高，提取出來的蛋白質變性析出會導致上清液中蛋白質含量降低，得率減小。因此，最適提取溫度均為65℃。

2.2.3 超聲波功率對蛋白質得率的影響

超聲波功率對蛋白質得率的影響見圖4。

圖4 超聲波功率對蛋白質得率的影響

由圖4可知，美味牛肝菌蛋白質得率隨超聲波功率的增大呈先增后減的趨勢，并在超聲波功率為400 W時達到最大，為16.028%。這是由于超聲波功率的增大，超聲波對細胞的破碎作用也越強，云南美味牛肝菌中蛋白質溶出也越多而使得率不斷增大；但超聲波功率過大時部分蛋白質發生變性，導致得率降低。因此，最適超聲波功率為400 W。

2.2.4 氫氧化鈉溶液質量濃度對蛋白質得率的影響

圖5 氫氧化鈉質量濃度對蛋白質得率的影響

氫氧化鈉質量濃度對蛋白質得率的影響見圖5。由圖5可知，美味牛肝菌蛋白質的得率隨著氫氧化鈉溶液質量濃度的升高呈現先增大后減小的變化趨勢，并在氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L時達到最大，為16.515%。這是因為蛋白在堿性條件下溶解度較大，所以堿液濃度越高蛋白質得率越高；但當堿液濃度過高，蛋白質二、三級結構解體而引起變性，導致蛋白質得率降低，因此最適氫氧化鈉溶液質量濃度為7 g/L。

2.2.5 提取時間對蛋白質得率的影響

提取時間對蛋白質得率的影響見圖6。

圖6 提取時間對蛋白質得率的影響

由圖6可知，美味牛肝菌蛋白質得率隨提取時間的延長呈先增后減的趨勢，提取時間2 h時得率最高，為16.956%。提取時間過長，蛋白質會凝聚沉淀，導致蛋白質得率降低。因此，最適提取時間為2 h。

2.3 正交試驗

基于單因素的試驗結果，建立L9（34）正交試驗。

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果

由表2可知，影響美味牛肝菌蛋白質得率的因素由大到小依次為B（提取溫度）>A（料液比）>C（氫氧化鈉溶液質量濃度）>D（提取時間），超聲波輔助堿法提取美味牛肝菌蛋白質的最佳條件為A2B3C3D2，即料液比1∶60（g∶mL），提取溫度75℃，超聲波功率450 W，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，提取時間2 h，在此工藝條件下進行驗證，蛋白質得率為17.001%。

2.4 美味牛肝菌蛋白質的溶解性

2.4.1 提取溫度對蛋白質溶解性的影響

提取溫度對蛋白質溶解度的影響見圖7。

圖7 提取溫度對蛋白質溶解度的影響

由圖7可知，當提取溫度為70℃時美味牛肝菌蛋白質的溶解度最小；提取溫度在30~60℃時升溫有助于蛋白質的溶解；在60~70℃時，隨著提取溫度的升高，美味牛肝菌蛋白質發生變性，導致溶解度降低；當溫度超70℃時，可能因為部分蛋白質分子的聚集體轉化為可溶性聚集體，而造成蛋白質溶解度增大，這說明高溫處理可以改善美味牛肝菌蛋白質的溶解性。

2.4.2 pH值對蛋白質溶解性的影響

pH值對蛋白質溶解性的影響見圖8。

圖8 pH值對蛋白質溶解性的影響

由圖8可知，當pH值4.0時接近等電點，故美味牛肝菌蛋白質的溶解度較小，當pH值不斷增大，美味牛肝菌的溶解度也隨之增大。pH值對蛋白質的解離性和帶電性影響很大，改變了蛋白質同水的結合能力，從而影響其溶解性。

2.4.3 離子強度對蛋白質溶解性的影響

氫化鈉溶液質量分數對蛋白質溶解性的影響見圖9。

圖9 氫化鈉溶液質量分數對蛋白質溶解性的影響

由圖9可知，pH值為2和4時美味牛肝菌蛋白質的溶解性變化隨氯化鈉溶液質量分數增加表現不明顯，溶解性差于其他pH值條件；在pH值6時的溶解性隨氯化鈉溶液質量分數的增加略有提升，可能由于蛋白質表面的電荷增加利于蛋白質溶解，而后繼續增大氯化鈉溶液質量分數時發生鹽析而導致溶解度下降；在pH值為8和10時的堿性條件下蛋白質帶較多靜電荷，但鹽溶液的正負離子屏蔽了靜電荷，同時氯化鈉與蛋白質爭奪水分子的能力增強，使蛋白質溶解性降低。

2.5 美味牛肝菌蛋白質的功能性質分析

美味牛肝菌蛋白質的功能性質分析見表3。

表3 美味牛肝菌蛋白質的功能性質分析 /%

由表3可知，美味牛肝菌蛋白質與香椿籽蛋白質、菜籽蛋白質、大豆分離蛋白質和美藤果蛋白質相比，在起泡性方面具有較顯著的優勢，持水性和泡沫穩定性略高于香椿籽蛋白質，但持水性和持油性明顯低于其他幾種蛋白質。功能性質方面的差異主要與蛋白質的分子結構、濃度、分子間相互作用等因素有關，美味牛肝菌蛋白質分子能快速地擴散到氣-液界面并通過分子間作用形成黏彈性的吸附膜。

3 結論

影響美味牛肝菌蛋白質的超聲提取因素主要有料液比、提取時間、氫氧化鈉溶液質量濃度和提取溫度，在單因素試驗結果的基礎上采用正交試驗優化得出美味牛肝菌蛋白質的最佳超聲波提取條件，即料液比1∶60（g∶mL），提取溫度75℃，超聲波功率450 W，氫氧化鈉溶液質量濃度7 g/L，提取時間2 h，此條件下蛋白質得率為17.001%。

提取溫度、pH值和離子濃度對美味牛肝菌蛋白質溶解性的影響不同，較高提取溫度和pH值、較低離子濃度對美味牛肝菌蛋白質的溶解特性是有利的。美味牛肝菌蛋白質在起泡性方面優于香椿籽蛋白質、菜籽蛋白質、大豆分離蛋白質和美藤果蛋白質，持水性和泡沫穩定性略高于香椿籽蛋白質，但持水性和持油性明顯低于其他幾種蛋白質。