響應面法優化梔子中綠原酸的提取工藝

易夢媛，鄧愛華，劉鳳英，王 云，謝 鵬，盧俊明，王 志

（1.湖南文理學院生命與環境科學學院，湖南常德 415000；2.湖南文理學院芙蓉學院，湖南常德 415000；3.澧縣扶農中藥材農民專業合作社，湖南常德 415000）

0 引言

梔子（Gardenia jasminoides Ellis）作為我國傳統藥材，藥用價值廣泛[1-3]，主產于贛、鄂、閩、湘、浙等地[4-5]。綠原酸在梔子中作為有機酸脂類物質存在，其含量為0.003%~0.114%[6-7]，梔子可作為綠原酸的提取材料來源。綠原酸為極性有機酸，在常溫水中的溶解度為4%左右[8]，因此試驗中選取極性較強的甲醇作為提取溶劑，摸索出梔子中提取綠原酸的最佳工藝條件，以期為梔子中綠原酸的提取提供理論依據和生產指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

梔子果，湖南廣源生物科技有限公司提供；綠原酸標準品，北京盛世康普化工技術研究院提供；甲醇（AR），德州潤昕實驗儀器有限公司提供；其他試劑（AR），國藥試劑提供。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平，賽多利斯有限公司產品；電熱鼓風干燥箱、中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；高速離心機，上海安寧科學儀器廠產品；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒儀器有限公司產品；紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標準曲線制備

精密稱取1.3 mg的綠原酸標準品，用體積分數50%甲醇溶液定容為100 mL，搖晃均勻，制成13 μg/mL 的母液。分別吸取 2，3，4，5，6，7，8，9，10 mL的母液于10 mL的容量瓶中加入50%甲醇定容至10 mL，得到質量濃度分別為2.6，3.9，5.2，6.5，7.8，9.1， 10.4，11.7，13 μg/mL 的標準溶液，以50%甲醇溶液為空白對照，于波長324 nm處測定吸光度。以綠原酸標準品質量濃度為橫坐標（C）、吸光度為縱坐標（A），繪制標準曲線。得綠原酸的標準曲線方程為A=0.046C-0.017，R2=0.999 7，R接近于1，表明綠原酸質量濃度在0.170~0.513 mg/mL時與吸光度線性關系良好。

1.2.2 單因素試驗

稱取2.0 g梔子粉末，在超聲功率70 W，超聲時間25 min，甲醇體積分數50%，料液比1∶20，超聲溫度50℃的條件下，分別考查超聲功率40，50，60，70，80，90，100 W；超聲時間 15，20，25，30，35 min；甲醇體積分數30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%；料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30；超聲溫度40，50，60，70，80℃時對梔子果粉中綠原酸提取率的影響。

1.2.3 響應面分析設計

通過單因素試驗得到影響綠原酸提取的3個主要因素超聲功率、超聲時間、甲醇體積分數，確定其水平值，并使用Design Expert（Version 8.0.6） 軟件對各因素及水平進行Box-Behnken響應面設計和數據分析。以A，B，C分別表示超聲功率、超聲時間、甲醇體積分數，每個因素的高中低水平分別以1，0，-1編碼。

響應面試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平

1.2.4 樣品中綠原酸含量測定

將所得綠原酸提取液以轉速2 500 r/min離心8 min，取上層清液，用甲醇稀釋100倍，用紫外分光光度計于波長324 nm處測定綠原酸的吸光度A324。以對應體積分數的甲醇溶液為空白對照。綠原酸提取量η（mg/g） 按如下公式計算：

式中：n——稀釋倍數；

C——稀釋后綠原酸質量濃度，mg/mL；

V——提取液總體積，mL；

m——干燥后梔子果實粉末的質量，g。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率對梔子中綠原酸提取率的影響

超聲功率對梔子中綠原酸提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對梔子中綠原酸提取率的影響

從圖1中可以看出，當超聲功率為40~70 W時，綠原酸提取率隨著超聲功率的升高而不斷增加，在70 W時達到最高值。繼續增大超聲功率，綠原酸提取率下降，可能是過高的超聲功率導致綠原酸降解或其他雜質被提取出來影響綠原酸提取效果。

2.1.2 超聲時間對梔子中綠原酸提取率的影響

超聲時間對梔子中綠原酸提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對梔子中綠原酸提取率的影響

從圖2中可以看出，15~20 min時綠原酸提取率上升最快，隨后在20~25 min內有所減緩，至25 min時提取率達到最大值。之后，隨著超聲時間的延長提取率反而下降，在30~35 min內下降最快，可能是長時間的加熱和超聲導致綠原酸這種不穩定物質受熱見光氧化分解及其他雜質析出導致提取率下降[9]。所以，選擇提取效果最佳的25 min作為超聲時間。

2.1.3 甲醇體積分數對梔子中綠原酸提取率的影響

甲醇體積分數對梔子中綠原酸提取率的影響見圖3。

圖3 甲醇體積分數對梔子中綠原酸提取率的影響

從圖3中可以看出，甲醇體積分數在30%~50%時綠原酸提取率較低，變化不明顯；甲醇體積分數在50%~70%時，綠原酸的提取率隨甲醇體積分數的增加而快速上升；在甲醇體積分數達到70%時，綠原酸的提取量達最大（0.065 33 g）；而當甲醇體積分數大于70%時，提取率反而下降。可能是在低體積分數甲醇溶劑浸提下，果實中的果膠和蛋白質等黏稠狀雜質容易浸出，體積分數差較小，綠原酸的浸提效果不佳；在高體積分數甲醇溶劑浸提下，提取率下降，可能是綠原酸結構中含有多個親水性羥基基團，高體積分數甲醇中含水量少，綠原酸的提取率因此而下降。所以，選擇70%甲醇體積分數作為提取溶液。

2.1.4 料液比對梔子中綠原酸提取的影響

料液比對梔子中綠原酸提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對梔子中綠原酸提取率的影響

從圖4中可以看出，在溶質質量不變的情況下綠原酸的提取率隨著溶劑的增加而增加，可能是隨著溶劑的增多綠原酸在甲醇中溶解的飽和度增高，固體與液體的接觸面積加大，梔子中的綠原酸能夠充分析出，增加了提取效果。

2.1.5 超聲溫度對梔子中綠原酸提取率的影響

超聲溫度對梔子中綠原酸提取率的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對梔子中綠原酸提取率的影響

從圖5中可以看出，超聲溫度在40~60℃時，綠原酸的提取率隨著溫度的升高上升明顯；60℃時綠原酸的提取率也達到最大值（0.049 57 g）；而當超聲溫度為60~80℃時，綠原酸提取率下降明顯，甚至綠原酸提取率的下降率要高于在40~60℃時綠原酸提取率的上升率。從圖5曲線的變化趨勢中也可以看出超聲溫度的升高有利于綠原酸的提取，但過高的超聲溫度也會導致綠原酸產生水解和出現分子內酯基遷移，異構化成新綠原酸和隱綠原酸，進而導致綠原酸的提取率下降[10]。所以，選擇提取效果最佳的60℃作為超聲溫度。

2.2 響面分析試驗結果

2.2.1 響應值結果及其擬合模型

選取超聲功率、超聲時間和甲醇體積分數3個因素，對提取工藝進行響應面分析。

響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 模型方程的建立及顯著性分析

在不同超聲功率、超聲時間、甲醇體積分數下測定的綠原酸提取率，利用Design Expert 8.0對表2中綠原酸提取率進行多元線性回歸擬合。

綠原酸提取率回歸模型及其顯著性檢驗見表3。

表3 綠原酸提取率回歸模型及其顯著性檢驗

超聲功率、超聲時間和甲醇體積分數與綠原酸提取率的多元二次回歸方程為：

式中：R——綠原酸提取率，%；

A——超聲功率，W；

B——超聲時間，min；

C——甲醇體積分數，%。

2.2.3 綠原酸提取率的響應面分析

利用Design Expert 8.0軟件結合不同超聲功率、超聲時間和甲醇體積分數做出交互作用條件下的響應面圖。

超聲時間與超聲功率對綠原酸提取率的影響見圖6，甲醇體積分數與超聲功率對綠原酸提取率的影響見圖7，甲醇體積分數與超聲時間對綠原酸提取率的影響見圖8。

圖6 超聲時間與超聲功率對綠原酸提取率的影響

圖7 甲醇體積分數與超聲功率對綠原酸提取率的影響

圖8 甲醇體積分數與超聲時間對綠原酸提取率的影響

從圖6~圖8中可以看出，3個影響因子單獨對梔子中綠原酸提取率的影響大小依次為超聲功率>甲醇體積分數>超聲時間，而3個影響因子交互作用對梔子中綠原酸提取率的影響大小依次為超聲功率、甲醇體積分數>超聲功率、超聲時間>甲醇體積分數、超聲時間。從圖6中可以看出，在過長或過短的提取時間下綠原酸提取率都不高，但在高超聲功率下長時間的提取有利于綠原酸的析出。從圖7中可以看出，在中等甲醇體積分數和中等超聲功率下的綠原酸提取效果最佳。從圖8中可以看出，在過長時間的甲醇中綠原酸的提取率會下降，在中等甲醇體積分數下短時間的提取有利于綠原酸的析出。

3 結論

采用超聲波輔助甲醇提取綠原酸的最佳工藝參數為超聲功率72.87 W，超聲時間18.46 min，甲醇體積分數60.54%；在此條件下，綠原酸提取率為5.68%。超聲功率、超聲時間和甲醇體積分數對綠原酸提取率影響的程度大小依次為超聲功率>甲醇體積分數>超聲時間，3個影響因子交互作用對綠原酸提取率的影響程度大小依次為超聲功率、甲醇體積分數>超聲功率、超聲時間>甲醇體積分數、超聲時間。甲醇的極性和超聲波產生的超聲振蕩及空穴效應有利于綠原酸的析出[11]，避免了綠原酸見光加熱易分解的問題，縮短了提取時間，提高了提取效率。