一株煙葉內源菌的鑒定及其在煙草提取物中的應用

衛 青，崔洪亮，曹 環，劉 鶴，馬 林

(1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450002；2.云南瑞升煙草技術(集團)有限公司，云南昆明 650106)

隨著煙草行業提出要加快培育以“高香氣、高品質、低焦油、低危害”為主導的品牌體系，造紙法再造煙葉的應用更加廣泛[1]。在卷煙配方中添加再造煙葉能夠有效降低焦油[2-3]、苯酚[4]、NNK、NNN、NAB、NAT[5]等有害成分。然而，由于生產再造煙葉的主要原料是煙梗和碎煙，使其香氣淡薄、刺激和雜氣較重[6]，嚴重影響卷煙的感官品質，最終導致再造煙葉在卷煙中摻配比例很難達到10%以上。

煙葉經收獲調制后，其表面存在大量微生物，且這些微生物貫穿煙葉發酵的始終[7]。特別是其中一些微生物能夠直接或間接產生生物酶，可以將煙草原料中的多糖、蛋白質等大分子物質分解、轉換成還原糖、氨基酸等小分子物質，這些小分子物質之間可以發生類似美拉德反應，從而促進致香成分的生成，提升感官品質[8]。利用微生物技術提高煙葉品質方面的研究已有較多報道[9-11]，然而這些研究大多集中在利用細菌[12-13]及酵母菌[14]等提高煙葉品質方面。直接利用真菌菌劑應用于造紙法再造煙葉煙膏，提高再造煙葉抽吸品質的研究還鮮少報道。筆者對一株煙草內源真菌進行鑒定，并利用該菌株菌劑處理再造煙葉煙膏，旨在探討真菌菌劑提高再造煙葉煙膏品質的可行性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。2012年從紅大煙葉中篩選獲得一株產蛋白酶及多糖酶的真菌RSCT26，菌種現保存于云南瑞升煙草技術(集團)有限公司菌種庫。

1.1.2培養基。菌種RSCT26活化和發酵所用培養基均為自制煙膏培養基。液體培養基為煙膏(云南中煙再造煙葉有限責任公司提供)100 mL，水900 mL，自然pH；固體培養基為煙膏100 mL，水900 mL，瓊脂15 g，自然pH。

1.1.3儀器。OLYMPUS-BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；ABS204-S電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)FW-400A高速粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)；SKY-211B恒溫培養振蕩器(昆明納瑞科技有限公司)；Eppendorf核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；4N/7620401005紫外可見分光光度計(上海精密儀器有限公司)；KRK高濃盤磨(日本Kumagai Riki Kogyo公司)；AT-7890A/5975C Agilent GC-MS聯用儀(美國Agilent公司)。

1.2方法

1.2.1RSCT26形態學鑒定。將菌株RSCT26活化，然后接種到裝入10 mL固體培養基的培養皿中，7 d后觀察菌落形態并測量菌落直徑，并使用OLYMPUS-BX51光學顯微鏡觀察孢子形態，根據《真菌鑒定手冊》[15]和《真菌的形態和分類》[16]對菌株進行形態學鑒定。

1.2.2RSCT26分子鑒定。DNA提取采用CTAB法[17]，然后使用核酸蛋白測定儀測定提取DNA的濃度與純度。真菌轉錄間隔區(ITS)PCR擴增引物采用ITS1-F與ITS4[11]，引物ITS1-F序列為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，ITS4序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′。PCR反應體系(50 μL)如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，ITS1-F 1 μL，ITS4 1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.25 μL，DNA模板(50～100 ng/μL)1 μL，ddH2O 39.75 μL。PCR反應程序如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。測序工作由北京華大基因生物有限公司完成。

將所獲得的序列在NCBI網站(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網站進行在線Blast序列比對，選擇同源性高的序列作為參比對象，使用ClustalX 1.83軟件進行多序列比對分析，采用臨位相接法(Neighbor-joining)，應用MEGA 4.1軟件構建系統進化樹。

1.2.3RSCT26蛋白酶及多糖酶活的測定。RSCT26菌株活化，接入裝有300 mL煙膏液體培養基的1 L三角瓶中，28 ℃、160 r/min發酵96 h，每8 h取樣1次，10 000 r/min離心30 min，上清液過濾即得RSCT26菌劑，做3個平行樣，按照GB/T 23527—2009方法測定RSCT26菌劑多糖酶及蛋白酶酶活。

1.2.4RSCT26菌劑在再造煙葉煙膏中的應用。按照圖1再造煙葉生產工藝，取“1.2.3”制得的RSCT26菌劑，按5%質量分數添加到混合提取液中，40 ℃下處理60 min，滅活，濃縮獲得煙膏，涂布，切絲，制樣，對照樣為等比例添加滅活菌劑，其他試驗步驟與試驗樣品一致。

圖1 RSCT26菌劑處理工藝流程Fig.1 The process flow of RSCT26 preparation

1.2.5化學常規成分及致香成分的測定。按照煙草行業標準方法YC/T 159—2002、YC/T 160—2002、YC/T 161—2002、YC/T 162—2002、YC/T 217/2007、YC/T 166—2003測定煙膏中可溶性總糖、還原糖、總植物堿、總氮、氯、鉀及蛋白質含量。致香成分的檢測采用GC-MS聯用儀法[18-19]。數據統計與分析使用Excel 2010軟件和SPSS 19.0統計軟件進行。

1.2.6感官評價。取“1.2.4”中所得樣品手工打煙，恒溫恒濕[(22±1)℃、(60±2)%]平衡48 h，組織云南瑞升煙草技術(集團)有限公司的專家組按照煙草行業標準YC/T498—2014對再造煙葉樣品進行感官品質評價。

2 結果與分析

2.1菌株RSCT26的形態學鑒定對分離純化的菌株RSCT26進行培養，經觀察發現RSCT26菌落呈圓形，黑褐色，培養7 d直徑約5.5 cm。在OLYMPUS-BX51光學顯微鏡下制片拍照，如圖2所示，菌絲有橫隔，孢子梗從菌絲生出，直或彎曲，單生，分隔，分枝，分生孢子呈倒梨形、倒棒狀或近橢圓形，具有3～5個橫隔，具有縱、斜隔，分隔處略有縊縮，孢子大小約15.0 μm×6.0 μm。經初步鑒定，確定其為鏈格孢屬真菌。

圖2 菌株RSCT26的孢子形態Fig.2 Spore morphology of RSCT26 strain

2.2菌株RSCT26分子鑒定將菌株RSCT26的ITS區序列用BLAST軟件與GenBank數據庫中已發表的ITS區序列進行同源性比較，選取同源性在95%以上的9株真菌，以PyrenochaetopsispoaeKJ869117為外群，構建系統發育樹(圖3)。由圖3可知，菌株RSCT26與已報道的鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)親源關系最近，且有99%以上的相似性。這也表明菌株RSCT26在分類學地位上歸屬于鏈格孢屬，結合“2.1”中形態學鑒定結果，將菌株RSCT26鑒定為鏈格孢屬真菌(Alternariaalternata)。

圖3 菌株RSCT26的ITS區系統發育樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of RSCT26 based on ITS region

2.3多糖酶及蛋白酶酶活菌株RSCT26發酵96 h，每8 h取樣并檢測多糖酶及蛋白酶酶活，結果見圖4。從圖4可以看出，隨著發酵時間的增加，2種酶酶活不斷升高。多糖酶酶活在64 h時達到最大值(482.12 U/mL)，保持12 h左右，然后開始降低；蛋白酶在72 h基本達到峰值(47.89 U/mL)，直到96 h基本變化不大；2種酶在發酵72 h時基本都處于酶活峰值，因此在后續試驗中選取該時間點來獲取菌劑。

圖4 菌株RSCT26的蛋白酶和多糖酶酶活Fig.4 The protease and polysaccharidase activities of RSCT26 strain

2.4RSCT26菌劑處理后煙膏化學常規成分及致香成分的變化RSCT26菌劑處理后煙膏化學成分變化如表1所示。由表1可知，與對照樣相比，RSCT26菌劑處理后幾種主要有機質成分含量發生了顯著變化，煙膏中可溶性總糖和還原糖含量顯著增加，蛋白質和總氮含量降低，RSCT26菌劑多糖酶酶活較高，多糖酶將煙膏中的多糖分解為還原糖和二氧化碳，蛋白酶分解蛋白質轉化為氨基酸，而且這些還原糖與氨基酸發生美拉德反應，形成致香物質[20]，二氧化碳揮發進入空氣，最終表現為可溶性總糖和還原糖含量增加，蛋白質和總氮含量有一定幅度降低；其他化學成分(如鉀離子、總植物堿、氯離子)變化不大。鄭勤安[21]利用2種菌及1種蛋白酶混合配制成的煙草發酵增質劑處理煙草原料萃取濃縮液，可溶性總糖和還原糖含量增加，蛋白質含量降低，煙草品質得到很大提升，此結果與該研究結果相一致。

煙草中糖類和氨基酸發生美拉德反應的主要產物雜環類化合物是煙草香味的主要來源之一，能夠增加堅果香、烘烤香、焦糖香等香味[21]。通過GC-MS對煙膏致香成分的含量進行檢測，結果見表2。RSCT26菌劑處理后煙膏中雜環類化合物增幅最大，達到64.930%。有機酸類物質也是煙草中一類重要的香味成分，等級越高、品質越好的煙葉有機酸含量越高[22]，而且在煙草發酵過程中微生物分解果膠和木質素等大分子化合物也可以產生有機酸[21]。RSCT26菌劑處理后煙膏中糠酸和棕櫚酸含量均大幅度增加，有機酸類物質總量增加53.530%。RSCT26菌劑處理后煙膏中一些重要致香成分(如二氫獼猴桃內酯、巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、二氫大馬酮等)均有一定程度增加。此外，RSCT26菌劑處理后煙膏中酮類化合物、醇類化合物和醛類化合物含量均有不同程度增加，而致香成分總量增加21.559%，表明RSCT26菌劑處理有利于增加煙膏中致香成分總量，從而提高煙膏的品質。

表1 RSCT26菌劑處理后煙膏化學常規成分的檢測結果

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Note：Different lowercase letters in the same column indicated significant differences(P<0.05)；Different capital letters in the same column indicated significant differences(P<0.01)

表2 RSCT26菌劑處理后煙膏致香成分檢測結果

接下表

2.5感官評價對RSCT26菌劑處理與未處理的煙膏進行再造煙葉中應用，并進行感官評價，結果表明RSCT26菌劑處理后，與對照樣品相比再造煙葉產品香氣質較好、香氣量較足，刺激和雜氣方面都有所改善，但在香氣豐富性上依然有所欠缺。

3 結論

通過形態學及分子生物學相結合的手段，將菌株RSCT26鑒定為鏈格孢屬(Alternariaalternata)，該菌株發酵72 h多糖酶及蛋白酶酶活達到峰值，用該菌株菌劑處理再造煙葉煙膏，與對照相比，處理后煙膏可溶性總糖和還原糖含量顯著增加，總氮和蛋白質含量顯著降低，幾大類主要致香成分含量均顯著增加。感官評價結果表明，RSCT26菌劑處理后再造煙葉香氣質變好，香氣量變足，刺激和雜氣變小。大量研究表明，鏈格孢屬真菌大多為煙葉致病菌，將該菌株應用于生產時還需對其安全性進行進一步應用評價。