銹毛莓總三萜超聲提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性研究

馬曉莉，葉 齊，寧書菊，蔡國倩，公培民，魏道智*

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控中重點實驗室，福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控中重點實驗室，福建福州 350002；3.福建農(nóng)林大學作物學院，作物生態(tài)與分子生理學福建省高校重點實驗室，福建福州 350002)

銹毛莓(RubusreflexusKer.)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)藥用植物，其根莖均能入藥。銹毛莓含有多種有效的化學成分，具有多種藥理活性和較高的藥用價值，福建閩南客家和畬族民間多用銹毛莓根、莖煲湯做茶飲，治療肝火虛妄、目赤腫痛，以宣泄肝火，被譽為保肝護肝良藥[1]。萜類是懸鉤子屬植物中含量較高的成分，從懸鉤子屬植物中分離到的萜類化合物主要是二萜、三萜以及少數(shù)單萜，其中三萜類占多數(shù)[2-4]。目前對銹毛莓總三萜的研究甚少，實驗室已通過液相方法確定銹毛莓醇提物中含有熊果酸和齊墩果酸，在前期預試驗中發(fā)現(xiàn)銹毛莓總三萜對肝損傷小鼠有一定的修護作用，為提高銹毛莓總三萜的利用率，該試驗優(yōu)化總三萜提取工藝，并確定其抗氧化活性，以期為后期銹毛莓三萜類成分的研究奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑銹毛莓干燥根莖購自福建龍巖(由福建農(nóng)林大學魏道智教授鑒定)；熊果酸標準品(上海麥克林生化科技有限公司)；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)均購于北京索萊寶科技有限公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、水楊酸、雙氧水(H2O2)、七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、過二硫酸鉀(K2S2O8)均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器FA2004電子分析天平，上海上平儀器公司；5804R離心機，艾本德有限公司；超純水機，四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DLSB低溫冷卻循環(huán)系統(tǒng)，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；101-1AB電熱鼓風干燥器，天津市泰斯特儀器有限公司；FW-80高速萬能粉碎機，上海新諾儀器設備有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1標準曲線的繪制。精密稱取熊果酸標準品12.3 mg，加無水乙醇定容至25 mL，制成0.492 mg/mL的標準溶液，分別吸取0、25、50、100、200、300、400、500和600 μL于比色管中，將比色管置于水浴鍋揮干，冷卻至室溫。加200 μL的5%香草醛-冰醋酸和800 μL高氯酸，搖勻，于70 ℃水浴15 min，冰水冷卻至室溫，加5 mL冰醋酸，搖勻，于546 nm處測吸光度，以熊果酸質(zhì)量(μg)為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線[5-6]，得到回歸方程Y=0.004 6X+0.042 3，R2=0.999 2，對照品含量在0～295.2 μg呈良好的線性關系。

1.3.2銹毛莓總三萜提取工藝及其含量測定。將銹毛莓根莖于60 ℃烘干，粉碎過60目篩，準確稱取銹毛莓粉末2.0 g，按照設定的不同條件進行超聲提取，乙醇補足失重，抽濾得濾液。參照“1.3.1”方法于546 nm處測吸光度，代入回歸方程，計算銹毛莓總三萜的含量及提取率。

總三萜提取率=(m×V)/(M×v)×100%

(1)

式中，m為代入回歸方程計算所得總三萜質(zhì)量；M為銹毛莓粉末質(zhì)量；v為參加反應加入的提取液體積；V為提取液總體積。

1.3.3單因素試驗。采用超聲提取銹毛莓總三萜，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲功率、超聲溫度進行單因素試驗，分別考察它們對銹毛莓總三萜提取率的影響。

1.3.4響應面優(yōu)化設計。通過單因素試驗分析，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，以料液比、超聲時間、超聲功率、乙醇體積分數(shù)為因素進行組合設計，并用響應面分析方法優(yōu)化銹毛莓總三萜的提取條件。

1.3.5銹毛莓總三萜抗氧化活性研究。

1.3.5.1銹毛莓總三萜對·OH清除能力的測定。在比色管中依次加入等體積(1 mL)不同濃度的銹毛莓總三萜溶液、9 mmol/L的FeSO4·7H2O溶液、9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液、6 mL去離子水，搖勻，37 ℃水浴30 min，于510 nm測吸光度[7-8]，以等量75%乙醇代替樣品做空白對照組，以VC做陽性對照，每組平行測定3次，按式(2)計算清除率。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%

(2)

式中，A0為空白對照組的吸光度，Ai為樣品或陽性對照溶液吸光度。

1.3.5.2銹毛莓總三萜對DPPH·清除能力的測定。用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，取2 mL DPPH溶液，以少量多次的方式加入銹毛莓總三萜溶液，邊加邊混勻，觀察DPPH溶液的褪色情況，記錄加入藥量，配制適宜濃度的銹毛莓總三萜溶液。

在比色管中依次加入不同質(zhì)量濃度(0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16和0.20 mg/mL)的銹毛莓總三萜溶液1 mL、0.2 mmol/L的DPPH溶液2 mL，旋渦混勻，避光反應30 min后517 nm波長處測吸光度[9]。以等量75%乙醇代替樣品做空白對照組，以VC做陽性對照，每組平行測定3次，按式(3)計算清除率。

清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(3)

式中,A0為空白對照組的吸光度；Ai為樣品或陽性對照溶液吸光度；Aj為無水乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.5.3銹毛莓總三萜對ABTS+·清除能力的測定。取等量7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的K2S2O8溶液旋渦混勻，在室溫下避光反應16 h，用無水乙醇稀釋，直至其吸光度在波長734 nm處為0.70±0.02，即為ABTS+·工作液。

在比色管中依次加入3.2 mL ABTS+·工作液和0.8 mL不同質(zhì)量濃度(0、0.001 25、0.002 50、0.006 25、0.012 50、0.018 75、0.025 00、0.031 25、0.037 50和0.050 00 mg/mL)的總三萜溶液，旋渦混勻，避光反應6 min，在734 nm波長處測吸光度[10-11]。以等量75%乙醇代替樣品做空白對照組，VC做陽性對照，每組平行測定3次，按式(4)計算清除率。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%

(4)

式中，A0為空白對照組的吸光度，Ai為樣品或陽性對照溶液吸光度。

2 結果與分析

2.1銹毛莓總三萜單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數(shù)對總三萜提取率的影響。精確稱取15份銹毛莓粉末，按料液比1∶20(g∶mL)加入不同體積分數(shù)的乙醇溶液(55%、65%、75%、85%和95%)，每組3個平行，超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃，超聲提取30 min，補足失重，抽濾測總三萜含量。結果如圖1所示，總三萜提取率隨乙醇溶液體積分數(shù)的增加先增后減，當乙醇體積分數(shù)為75%時達到最大值。

圖1 乙醇體積分數(shù)對銹毛莓總三萜提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.2料液比對總三萜提取率的影響。精確稱取15份銹毛莓粉末，按不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)加入95%的乙醇溶液，每組3個平行，超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃，超聲提取30 min，補足失重，抽濾測總三萜含量。結果如圖2所示，總三萜提取率隨料液比的增加先增后減，在一定范圍內(nèi)增加料液比，有利于三萜類成分析出，當料液比達1∶30時，提取率達到最大值。

圖2 料液比對銹毛莓總三萜提取率的影響Fig.2 Effect of materia-liquid ratio on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.3超聲時間對總三萜提取率的影響。精確稱取18份銹毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃，分別超聲提取15、30、45、60、75和90 min，每組3個平行，補足失重，抽濾測總三萜含量。結果如圖3所示，在60 min內(nèi)，銹毛莓總三萜提取率隨提取時間的增加而增加，且增加幅度不斷增大。60 min以后，提取率隨超聲時間的增加而減少，可能是提取時間過長，使其他成分析出，抑制了三萜類成分的提取。

圖3 超聲時間對銹毛莓總三萜提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.4超聲功率對總三萜提取率的影響。精確稱取21份銹毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超聲溫度60 ℃，采用不同超聲功率(200、250、300、350、400、450和500 W)，每組3個平行，超聲提取15 min，補足失重，抽濾測總三萜含量。結果如圖4所示，銹毛莓總三萜提取率隨超聲功率的增大先增后減。功率過大，可能會破壞三萜類成分，或有益于其他成分析出，從而抑制三萜類成分的提取，故選取提取功率為400 W。

圖4 超聲功率對銹毛莓總三萜提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

2.1.5超聲提取溫度對總三萜提取率的影響。精確稱取18份銹毛莓粉末，按料液比1∶20加入95%的乙醇溶液，超聲功率350 W，采用不同的超聲溫度(30、40、50、60、70和80 ℃)，每組3個平行，超聲提取15 min，補足失重，抽濾測總三萜含量。結果如圖5所示，在30～80 ℃，銹毛莓總三萜提取率隨溫度的升高而增加，故選擇實驗室超聲所能達到的最高溫度80 ℃進行后續(xù)試驗。

圖5 超聲提取溫度對銹毛莓總三萜提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic extraction temperature on extraction rate of total triterpenes from Rubus reflexus

表1 因素與水平

表2 試驗設計及結果

利用Design-Expert 8.06對各因素之間的交互作用做出相應的響應面圖和等高線圖。響應面圖坡度越陡，說明該因素對總三萜的提取率影響越大；等高線圖圓形說明2個因素交互作用不顯著，橢圓說明2個因素交互作用顯著[14]。如圖6所示，在交互項對總三萜提取率的影響中，超聲時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用顯著，其他不顯著，與方差分析結果一致。

圖6 各因素交互作用的響應曲面Fig.6 Responsive surface for the interaction of various factors

由各個響應面(圖6)可知，響應值存在最大值。利用Design-Expert 8.06軟件分析計算得出理論最佳提取工藝為料液比1∶28.12、超聲時間69.87 min、超聲功率410.23 W、乙醇體積分數(shù)83.43%，提取率為5.02%。結合實際選擇超聲溫度80 ℃，料液比1∶28、提取時間70 min、超聲功率400 W、乙醇體積分數(shù)83%。在此條件下，重復試驗3次，銹毛莓總三萜的提取率為5.06%，與理論值接近，說明該方程與實際擬合性較好。

2.3抗氧化活性

2.3.1對·OH的清除作用。不同濃度總三萜溶液對·OH的清除作用如圖7所示，在濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關系，根據(jù)非線性擬合得到VC的IC50=0.309 mg/mL，銹毛莓總三萜的IC50=9.467 mg/mL，說明銹毛莓總三萜具有較弱的清除·OH的能力，與VC清除能力相差較大。

圖7 銹毛莓總三萜對·OH的清除能力Fig.7 Scavenging activity of total triterpenes from Rubus reflexus to ·OH

2.3.2對DPPH·的清除作用。由圖8可知，隨銹毛莓總三萜濃度的升高，其對DPPH·的清除能力不斷增強，在試驗濃度范圍內(nèi)呈良好的量效關系，根據(jù)非線性擬合得到VC的IC50=0.023 mg/mL，銹毛莓總三萜的IC50=0.097 mg/mL，說明銹毛莓總三萜具有較強清除DPPH·的能力，且當達到較高濃度時，可基本清除。

2.3.3對ABTS+·的清除作用。由圖9可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著銹毛莓總三萜濃度的升高，其對ABTS+·的清除能力不斷增強，且呈現(xiàn)較好的量效關系，根據(jù)非線性擬合得到VC的IC50=0.019 mg/mL，銹毛莓總三萜的IC50=0.047 mg/mL。結果表明，銹毛莓總三萜對ABTS+·具有較強的清除作用，但其清除能力較VC弱。

圖9 銹毛莓總三萜對ABTS+·的清除能力Fig.9 Scavenging activity of total triterpenes from Rubus reflexus to ABTS+·

3 結論與討論

試驗以熊果酸為標準品，選用香草醛-冰醋酸顯色法測定總三萜含量，通過波長400～700 nm全波段掃描，確定最佳檢測波長為546 nm。采用超聲提取法，在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert 8.06軟件進行響應面優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為超聲溫度80 ℃、料液比1∶28、超聲時間70 min、超聲功率400 W、乙醇體積分數(shù)83%時，銹毛莓總三萜提取率為5.06%。

通過試驗，發(fā)現(xiàn)用75%乙醇可使三萜浸膏完全溶解，故在抗氧化試驗中以75%乙醇作為空白對照。體外抗氧化活性研究結果顯示，銹毛莓總三萜類的抗氧化能力具有濃度效應，尤其對DPPH·和ABTS+·的抗氧化能力較為顯著。因此，進一步加強銹毛莓三萜類化合物的研究，對于了解銹毛莓的有效活性成分和藥效學研究、指導臨床應用具有重要意義。