一株青刺果內生真菌的分離鑒定及抑菌試驗

楊嫦麗，鄭 鵬

(麗江師范高等專科學校，云南麗江 674100)

內生菌(endophyte)指的是一類其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物體內的，但對宿主植物不會引起明顯的病害癥狀的微生物[1]，普遍存在于植物各種組織中。最早在1993年由Stierle從紅豆杉中分離到一株能產生紫杉醇的內生真菌，并發現內生菌可以產生與宿主植物相同或相似的活性成分[2]，此后，植物內生菌的研究在國內外掀起熱潮，特別對藥用植物內生菌的研究成為一大熱點，據統計，已經開展內生菌研究的藥用植物有40多科100多種[3]，對藥用植物內生菌應用的分析和開發提出了可能性。大量研究表明，植物內生菌除了能產生與宿主植物相同功能的生物活性之外，某些藥用植物的內生菌還能夠獨立產生如抗生素之類的豐富次級代謝產物[4]。植物內生菌種類較多，包括內生細菌、內生真菌、內生放線菌，其生物學功能也比較豐富。內生菌與宿主植物協同進化，通常與宿主的生物學功能有一定的關聯[5]，所以植物內生菌的研究對其宿主植物的選擇也尤其重要。

青刺果(PrinsepiautilisRoyle)，為薔薇科扁核木屬(Pdnsepia)多年生的一種常綠灌木[6]，在我國主要分布于高原地區，在麗江主要分布于海拔2 300～3 200 m的高寒冷涼山區；用途廣泛，全身具有較高的營養和藥用價值，其莖、葉、果、根均可入藥，在云南，少數民族具有上千年的民間藥用、食用歷史。青刺果中分離的化合物具有動物紅細胞和淋巴細胞免疫功能，能提高機體免疫以及降血糖和降血脂[6-7]，其提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀菌和白色念珠菌等細菌、真菌具有較好的抑菌效果[8-13]。目前國內外對青刺果的化學成分和營養價值研究較廣泛，但對青刺果內生菌的研究報道較少[14]。筆者從青刺果中分離得到內生真菌3B-S，對其進行分類鑒定和抑菌檢測試驗，初步研究3B-S的抗菌作用，為后期青刺果與內生菌活性成分的研究以及植物內生菌的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1供試材料供試青刺果(PrinsepiautilisRoyle)采自麗江金山鄉新團片區田間。供試菌株膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌為麗江師范高等專科學校生物實驗室保藏。培養基為PDA培養基。

1.2試驗方法

1.2.1內生真菌3B-S的分離。取青刺果健康莖段表面沖洗干凈，晾干后蒸餾水沖洗3次，切成3 cm左右的小段浸泡于75%乙醇中30 s，再用無菌水沖洗數次，無菌濾紙吸干水分，切掉小莖段兩端露出新組織，再切成兩半接種于PDA平板，28 ℃暗培養14 d。待植物組織上有菌絲長出后，挑取菌絲于PDA培養基平板劃線分離純化，保存單菌落備用。

1.2.2內生真菌3B-S的鑒定。

1.2.2.1菌落特征觀察。用滅菌的打孔器對保存好的菌落進行打孔，菌餅放置于PDA培養基平板中央，于28 ℃培養7 d并觀察菌落特征。

1.2.2.2形態特征觀察。取打孔后的菌餅置于PDA平板中央，用插片法，用滅菌后的鑷子將4塊無菌蓋玻片豎直插入菌餅四周，于28 ℃培養，待菌絲長到蓋玻片上后，輕取出，用火焰稍加熱固定后棉蘭染色液染后，加工做成裝片，于光學顯微鏡下觀察形態。

1.2.3內生真菌3B-S抑菌檢測。備好用平板培養基培養好的膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌菌落、3B-S菌落，用滅過菌的打孔器分別對3B-S和2個病原菌進行打孔。取3B-S菌餅接種到PDA平板培養基中央，尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌菌餅接種于3B-S菌餅左邊，膠胞炭疽病菌餅接種在右邊，放于28 ℃恒溫中培養7 d進行對峙檢測，觀察抑菌情況。3個菌餅距離2 cm左右。

2 結果與分析

2.13B-S的分離和形態特征從青刺果莖段中成功分離得到內生真菌3B-S，純化培養成菌落，從圖1可觀察發現，內生真菌3B-S菌株呈絲狀，菌落最初灰白色，隨著培養時間逐漸長成黑色。菌絲體在平板上埋生或氣生，由菌餅向四周均勻生長，生長迅速，背面黑色。菌絲光滑，有隔多分支，分生孢子梗單身，分生孢子梗頂端膨大為瓶狀(圖2)。分生孢子單身，剛形成時半透明，成熟的分生孢子黑色，球形或扁球形。根據青刺果內生真菌3B-S的形態學特征，參照真菌分類鑒定方法、參考張敬澤等[15]研究，初步確定該菌為黑孢菌屬真菌。

圖1 菌株3B-S 菌落形態Fig.1 Colony morphology of strain 3B-S

圖2 3B-S菌絲和分生孢子形態Fig.2 Mycelium and conidia morphology of 3B-S

2.2內生真菌3B-S的初步抑菌監測內生真菌3B-S與膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌的對峙培養發現(圖3)，經過7 d培養后，內生真菌3B-S迅速生長，而膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌的生長均受到3B-S的抑制，逐漸被內生真菌3B-S菌絲覆蓋，有較明顯的抑菌效果，其中對膠胞炭疽病菌的抑制效果更為明顯。

圖3 內生真菌3B-S對尖孢鐮刀菌(區域A)和炭疽病菌(區域B)的對峙檢測Fig.3 Detection of endophytic bacteria 3B-S against Fusarium oxysporum(region A)and anthracnose(region B)

3 討論

隨著化學合成的部分農藥、化肥、醫藥等對人類賴以生存的生態環境和自身飲食健康產生不同程度的負面影響，人們對生活的需求越來越重視，探索新興的、生態綠色的代替品成為人類的重要目標。而植物內生菌被發現具有獨特的遺傳代謝，不僅對植物生長發育、植物抗逆性有重要的影響，還能產生抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性物質。因此，分離鑒定植物的內生菌，研究植物內生菌的抗菌活性和拮抗作用，在生物防治、醫藥研究、土壤改善等方面具有重要的意義和廣闊的前景。

該研究通過對內生菌形態特征觀察，從形態學上初步鑒定3B-S為黑孢菌屬真菌，但較系統的分類鑒定還需借助分子技術進一步的rDNA系列測定及系統進化分析。目前，黑孢菌屬被報道的種較為鮮見，該試驗發現的黑孢菌屬的分類鑒定和相關研究具有重要的意義。

抑菌檢測試驗中，青刺果內生真菌3B-S對膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌均有明顯的抑菌效果，說明內生真菌3B-S在抑菌研究方面具有一定的研究價值。青刺果本身的藥用價值有較大的開發潛力，前期已有大量研究證明青刺果化合物具有抗癌、抑菌等效果，而植物內生菌與宿主植物的生物學功能有關聯，因此研究青刺果內生菌具有開發和應用價值，但對植物病菌的抑制作用還需要大量的檢測，對內生菌的活性物質及與青刺果植物活性成分的關聯性還需進一步分析。