谷氨酸棒狀桿菌發酵生產L-精氨酸的溶氧條件優化

王 震

(華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 511400)

L-精氨酸是一種重要的半必需氨基酸，在有機體中參與刺激分泌，促進傷口愈合和一氧化氮的合成等多種生化過程，在食品、醫藥和保健行業有著廣泛的應用[1]。L-精氨酸的生產方法主要有化學催化、蛋白水解和微生物發酵，其中微生物發酵是生產L-精氨酸的主要方法[2]。在過去20年中，利用微生物發酵生產L-精氨酸的方法得到了深入的研究，包括基于基因工程和代謝工程的L-精氨酸工程菌株的構建和發酵工藝優化[3-4]。

谷氨酸棒狀桿菌作為L-精氨酸生產的主要菌類[5]，是一種革蘭氏陽性菌，符合食品生產安全，可用于工業發酵生產谷氨酸，然而大部分野生型谷氨酸棒狀桿菌都不具備積累L-精氨酸的能力[6]。在之前的工作中，以野生ATCC14067菌株為基礎，利用基因工程得到了一株具有L-精氨酸生產潛力的菌ATCC14067-SG(簡寫為SG)，SG通過替換強啟動子Peftu過表達了argGH、argC和icd基因，argB基因的268位組氨酸突變為谷氨酸，并把carA基因的起始密碼子突變成ATG，odhA基因的起始密碼子突變為GTG。在利用3 L發酵罐評價SG菌株的L-精氨酸積累能力時，發現L-精氨酸的積累產量較低，且伴隨著大量副產物的積累。L-精氨酸的發酵過程是一個需氧的過程，溶氧水平的高低不僅關乎菌體的生長繁殖速度，對于代謝產物的積累也具有不可忽略的影響[7]。在1993年，Dominguez等[8]發現，當溶氧不足時，谷氨酸棒狀桿菌ATCC17965會積累大量有機酸，如乙酸、琥珀酸和乳酸。為了減少代謝副產物的積累，提高L-精氨酸產量，筆者研究了5%、20%和35%這3種溶氧水平下，谷氨酸棒狀桿菌SG的生長與代謝變化，確定了最適合谷氨酸棒狀桿菌發酵積累L-精氨酸的溶氧方案。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。菌株為前期工作所構建的基因工程菌株SG(基于ATCC14067野生菌株，通過基因改造手段獲得)，華南理工大學酶學與酶工程實驗室保種。

1.1.2試劑。腦心浸液，購自美國BD公司；瓊脂、葡萄糖、大豆蛋白胨、酵母浸膏、NaCl、尿素、K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、NaHCO3、乙酸鈉等試劑購自廣州普博儀器(紐普諾博生物制品)有限公司；2，4-二硝基氟苯和乙腈購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3培養基。BHI固體平板：腦心浸液37 g/L，瓊脂20 g/L；BHI培養基：腦心浸液37 g/L；種子培養基：葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，酵母浸膏10 g/L，NaCl 2.5 g/L，尿素2 g/L；發酵培養基：葡萄糖80 g/L，大豆蛋白胨2 g/L，硫酸銨3.75 g/L，尿素10.25 g/L，MOPS 42 g/L，磷酸二氫鉀3.1 g/L，磷酸氫二鉀0.4 g/L，七水硫酸鎂0.375 g/L，七水硫酸鐵52 mg/L，氯化鈣14 mg/L，一水硫酸錳30 mg/L，七水硫酸鋅0.8 mg/L，無水硫酸銅1.96 mg/L，一水氯化鎳0.164 mg/L，生物素1.84 mg/L，PCA 295 mg/L，其中葡萄糖和尿素單獨滅菌；補料培養基：葡萄糖500 g/L，大豆蛋白胨10 g/L，(NH4)2SO420 g/L，其中葡萄糖單獨滅菌。

1.2發酵參數控制

1.2.1菌落劃線，活化及轉接。將實驗室保存的SG菌株在BHI固體培養基上劃線，30 ℃恒溫培養36 h。挑取單菌落接種至BHI培養基，30 ℃，250 r/min培養12 h。之后轉接至種子培養基，起始OD600控制在0.2左右，30 ℃，250 r/min培養36 h。之后接種至裝有1.5 L發酵培養基的3 L發酵罐中，接種量以起始OD600等于0.5來計算。

1.2.2發酵參數控制。溫度控制在30 ℃，硫酸銨調控pH穩定在6.8，溶氧調控分為高中低3個水平，分別為35%、20%和5%(固定通氣量為2 L/min，通過調節轉數來維持溶氧)。30 h之后以4.5 mL/h的恒定速率補充補料培養基，每6 h取樣。

1.3檢測方法

1.3.1生長檢測。用OD600表示菌體生長，取發酵液利用UV2350型紫外分光光度儀，在波長600 nm處檢測吸光值。

1.3.2殘糖檢測。利用SBA-40E生物傳感分析儀測定殘糖。

1.3.3氨基酸檢測。氨基酸的測定依據DNFB衍生法[9]。將菌液離心取上清，樣品稀釋5倍，之后取稀釋后的液體150 μL，加入pH 9.07、0.5 moL/L的NaHCO3150 μL，再加入DNFB溶液(準確吸取1 mL 2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容到100 mL)150 μL，混勻，在暗處60 ℃水浴反應1 h，反應完成后暗處冷卻至室溫，加入1 050 μL pH 7.0的PBS緩沖溶液，暗處靜置10 min，然后14 000 r/min離心10 min以去除雜質，最后用有機濾膜過濾轉移至進樣瓶。標準氨基酸溶液的處理同上。流動相A溶液為0.05 mol/L的乙酸鈉溶液。稱取無水乙酸鈉4.1 g，加入超純水990 mL，調節pH至6.8，再加入N，N-二甲基甲酰胺10 mL，有機濾膜過濾，然后超聲30 min排除氣泡。流動相B溶液是乙腈與水按55∶45的體積比配制，流速1 mL/min，檢測溫度30 ℃，檢測波長360 nm。液相型號為waters e2695，UV檢測器型號為Waters 2489，色譜柱為購自廣州菲羅門的Gemini NX C18(5 μm × 250 mm)。

1.3.4乳酸檢測。乳酸檢測利用液相色譜法。發酵液離心取上清，用2.5 mmol/L的H2SO4稀釋3倍，并用無機濾膜過濾。乳酸標準液處理如上。流動相為2.5 mmol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫為55 ℃，進樣量10 μL，檢測器為示差折光檢測器。色譜柱為Carbomix H-NP10，購自蘇州賽分科技有限公司。

2 結果與分析

2.1不同溶氧條件對SG生長和L-精氨酸積累的影響谷氨酸棒狀桿菌發酵生產L-精氨酸是一個需氧的過程，氧氣的供應對于谷氨酸棒狀桿菌的生長和代謝都有顯著的影響。發酵過程中的溫度和pH如圖1a、b所示。為了防止發酵后期營養物質的不足，在發酵進行到30 h時，以4.5 ml/h的恒定速率補充補料培養基(圖2a)。3種溶氧水平下的溶氧控制、SG的生長和L-精氨酸積累如圖2b、2c和2d所示，在3種溶氧水平下，SG的生長趨勢基本一致，其中20%溶氧水平的最高OD600要略高于5%溶氧和35%溶氧，且在發酵到達最高OD600之后，菌株的生長波動比較平穩，說明在發酵的中后期，20%的溶氧有助于保持正常的生理和代謝活性。

L-精氨酸的積累曲線顯示，20%溶氧水平下，SG的L-精氨酸積累要明顯優于35%溶氧和5%溶氧，在48 h時20%溶氧的L-精氨酸積累達6.38 g/L，為35%溶氧水平的117.28%，5%溶氧水平的140.53%。

圖1 谷氨酸棒狀桿菌SG發酵生產L-精氨酸的參數控制Fig.1 The fermentation parameter control of Corynebacterium glutamicum SG producting L-arginine

圖2 谷氨酸棒狀桿菌SG發酵生產L-精氨酸的溶氧、生長、耗糖及精氨酸積累曲線Fig.2 The DO，growth，sugar consumption and arginine accumulation curve of C. glutamicum SG producting L-arginine

2.2相關氨基酸和有機酸的代謝變化為了探究L-精氨酸差異的原因，分析了3種溶氧條件下SG的氨基酸和有機酸代謝變化，圖3是谷氨酸棒狀桿菌中精氨酸的代謝流程簡圖，圖4(a～f)是谷氨酸棒狀桿菌代謝途徑中，產量差異較大的6種雜酸的積累曲線。3種溶氧水平中，5%溶氧時6種雜酸的積累都為最高；在20%和35%這2種溶氧水平下，鳥氨酸、賴氨酸和乳酸的積累基本保持一致，而對于谷氨酸和丙氨酸，35%溶氧下的積累會更高。

在谷氨酸棒狀桿菌中，乳酸和丙氨酸同屬于丙酮酸的代謝產物，而丙酮酸是連接糖酵解途徑和TCA循環的關鍵節點[10]。乳酸和丙氨酸產量的提高會導致谷氨酸棒狀桿菌的TCA循環活力減弱，而賴氨酸合成的增加會進一步分流TCA循環中流向精氨酸的可利用碳源和能量。谷氨酸和鳥氨酸是L-精氨酸的代謝前提物質，其產量的增加表明谷氨酸轉化為L-精氨酸的代謝通路受阻[11]。

綜合以上分析，可以推斷出5%溶氧條件下TCA的代謝減弱，草酰乙酸的代謝產物賴氨酸合成增加，同時谷氨酸轉化為鳥氨酸以及鳥氨酸轉化為精氨酸的代謝通路受阻導致精氨酸的產量很低。35%溶氧條件下，雖然賴氨酸積累顯著減少，鳥氨酸轉化為L-精氨酸的通路正常，但丙氨酸和谷氨酸的積累仍然較高。20%溶氧條件下，丙氨酸、乳酸、賴氨酸和鳥氨酸的積累都維持在非常低的水平，而谷氨酸雖然積累較多，但相比較其他2種溶氧水平，已經有了明顯改善，因此，20%的溶氧條件最適合SG發酵生產L-精氨酸。

圖3 谷氨酸棒狀桿菌中L-精氨酸的代謝流程Fig.3 The metabolic process of L-arginine in C. glutamicum

圖4 谷氨酸棒狀桿菌SG發酵生產L-精氨酸的雜酸積累分析Fig.4 Analysis of the accumulation of by-products in L-arginine produced by C. glutamicum SG fermentation

3 結論

該試驗通過控制溫度、pH等，改變溶氧的發酵條件，探討了谷氨酸棒狀桿菌SG發酵生產精氨酸的生長與代謝規律，發現20%溶氧條件下，菌體在整個發酵過程中不會受到代謝副產物的積累而影響菌體正常的生理和代謝活性，菌體在發酵后期的生長會更穩定，有利于發酵產物的積累。且20%溶氧下，菌體發酵產生的副產物最少，碳源和能源可以更多地用于L-精氨酸的合成，因此L-精氨酸積累最多，得出結論：20%溶氧最適合于精氨酸的發酵生產。該試驗確定谷氨酸棒狀桿菌發酵過程中溶氧的控制策略，建立了基因工程菌株產酸能力的評價體系，對精氨酸的實際工業發酵生產具有參考價值。