氨氮脅迫對凡納濱對蝦的生長狀況及蝦肝腸胞蟲(EHP)攜帶量的影響

徐勝威，楊 程，斯烈鋼，申屠基康，沈偉良

(寧波市海洋與漁業研究院，浙江寧波 315000)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對蝦，隸屬甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對蝦科(Penaeidae)對蝦屬(Penaeus)，主要分布于太平洋海岸水域[1]。由于其肌肉成分中脂肪含量低，蛋白含量高，并富含多種飽和脂肪酸，使其具有較高的營養價值。凡納濱對蝦因其生長周期短，抗逆性強，經濟效益高，成為全球養殖產量最高的三大優良品種之一，并于20世紀80年代末引入我國，經過30多年的發展，其養殖面積不斷擴大，技術不斷更新，目前已成為我國水產品養殖面積最大的品種之一[2]。然而，由于凡納濱對蝦養殖產量高，經濟效益顯著，集約化養殖模式發展迅速，養殖密度逐漸提高，導致養殖環境的不斷惡化，養殖水體污染嚴重，其中氨氮作為重要的水質因子已成為影響水產養殖品種健康生長的主要因素之一。研究表明，在一定濃度的氨氮脅迫下水產病害極易發生和流行[3]。蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)屬于真菌界(Fungi)微孢子蟲門(Microsporidia)單倍期綱(Haplophasea)壺孢目(Chytridiopsida)腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲屬(Enterocytozoon)[4-5]，屬于細胞內寄生[6-7]，是目前影響對蝦養殖的主要疾病之一，最早于2009年在泰國發現，2013年我國第一次在養殖凡納濱對蝦中檢測出EHP，并有很高的感染率[8]。運用PCR檢測技術可以從感染EHP的凡納濱對蝦的水環境、排泄物及肝胰腺等器官中檢測出EHP[9-11]，其鰓、血淋巴、腸、心臟、肌肉組織也均可檢測到EHP[12-13]，但不同組織中EHP的含量差異及它們間的相互關系還不明確。感染后的對蝦仍可以繼續存活和進食，但會出現生長緩慢甚至停止生長現象，需要得到足夠重視，否則病原的大規模擴散會導致養殖戶浪費過多的飼料，造成嚴重的經濟損失[14-16]。

由于EHP的特殊存在方式，目前還沒有明確的治療藥物，所以在養殖過程中注意容易感染的環節，通過改善水體，輔助一些維生素、中草藥成分，可以起到一定的預防效果[17]。目前關于研究主要集中在氨氮對對蝦的急性毒性方面的研究[18-19]，關于EHP對對蝦的的生長狀況的研究較少[20-21]，而關于氨氮與EHP之間的關系研究鮮見報道。筆者研究了不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦體長和體重的影響，利用實時定量PCR技術分析氨氮脅迫對其EHP攜帶量的影響，以期為對蝦養殖業提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。試驗用蝦取自寧波市海洋與漁業科技創新基地，選取肢體完整、體格相近的凡納濱對蝦為試驗蝦，體長(4.0±0.5) cm，體重(0.38±0.02)g。試驗開始前，將凡納濱對蝦撈出分別放入9個試驗容器(600 L圓桶，300尾/桶)中暫養7 d，每天投喂4次(06：00、11：00、16：00、21：00)，餌料適量(以2 h內吃凈為準)。隨著凡納濱對蝦的生長，飼料由0號料變為1號料，餌料量隨之增加，投食改為每天3次(06：00、13：00、20：00)，每2 d換水1次，換水量為總體積的10%。

1.1.2試劑。DNA提取試劑盒(Tissue DNA Kit)購自Omega公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國)；氯化銨為分析純試劑(上海生工)。

1.1.3試驗用水。用經沙過濾處理的海水作為試驗用水，鹽度(24±1)‰，水溫(25±1)℃，pH為(8.0±0.2)，氨氮濃度為0.1 mg/ L，亞硝酸氮濃度為0.003 mg/ L，溶解氧含量為(6.5±0.5)mg/ L，水質符合 NY 5052—2001無公害食品海水養殖用水水質標準(中華人民共和國農業部2001)的要求；在試驗用基礎水中添加適量的NH4Cl母液，調配成不同濃度的NH4Cl試驗水。

1.2方法參考大量文獻并經過預試驗，設置0.1 mg/L(空白組)、6.0 mg/L(試驗組Ⅰ)、9.0 mg/L(試驗組Ⅱ)3個氨氮濃度組，每組3個平行，每個平行投放試驗對蝦300尾，試驗期為30 d，試驗期間每天投料4次，每天監測養殖水體氨氮濃度，并用NH4Cl母液穩定試驗所需的氨氮濃度。

1.2.1對蝦體長和體重的測定。將試驗對蝦投放試驗容器前，隨機選取100尾對蝦進行體長和體重的測定，并統計大蝦(體長>4.5 cm)、中蝦(體長4.0～4.5 cm)及小蝦(體長<4.0 cm)所占的比例，再取肝胰腺置于無水乙醇中-80 ℃下保存，備用；然后，每隔10 d從每個平行組中隨機取30尾凡納濱對蝦進行體長和體重的測定，并取肝胰腺置于無水乙醇中-80 ℃下保存，備用；每次采樣結束后，記錄每個組存活的蝦數目，計算不同氨氮濃度下凡納濱對蝦的EHP感染率和存活率；第4次采樣后，每組隨機取100尾蝦測量體長，并統計大蝦、中蝦及小蝦所占的比例。

1.2.2實時定量PCR檢測凡納濱對蝦的EHP攜帶量。

1.2.2.1標準曲線的繪制。取感染EHP的凡納濱對蝦肝胰腺提取的總DNA為模板，用定量用特異引物(引物EHP-F為5′-GACCAACGGAGGCGAAAGCG-3′，EHP-R為5′-CAACGGCCATGCACCACTCTT-3′)進行PCR擴增，將得到的目的片段連接、轉化后提取質粒，使用核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-2000，Thermo)測定所提質粒的濃度，將所測濃度的質粒按10倍梯度稀釋成13管，并采用實時定量PCR，以含有EHP基因片段的質粒濃度梯度所對應的CT值為縱坐標，以質粒濃度的稀釋倍數為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2實時定量PCR。采用三步法在ABI 7500上進行實時定量PCR，具體操作參照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國)試劑盒說明書。反應體系(20 μL)如下：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L EHP-F 1 μL、10 μmol/L EHP-R 1 μL、模板1 μL、ddH2O 7 μL。

將不同樣品中EHP基因的表達量所對應的CT值與標準曲線相對照，即可得到該樣品目的基因表達量的相對濃度值，最后根據含目的基因的質粒分子量，計算出樣品的拷貝數。

2 結果與分析

2.1EHP的標準曲線將含有EHP的質粒原液經10倍梯度稀釋后作為模板，進行熒光定量檢測。以含有EHP基因片段的質粒濃度梯度所對應的CT值為縱坐標，以質粒濃度的稀釋倍數為橫坐標，繪制標準曲線。從圖1可以看出，線性回歸方程R2為0.998 2，線性較好，且經預試驗確定樣品濃度在曲線區間內。

2.2不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率和感染率的影響由圖2可知，0～10 d各組EHP感染率上升幅度較大，10～30 d趨于平穩；空白組先于試驗組達到100%感染率，氨氮濃度越低，EHP感染率越早達到峰值，表明氨氮對EHP影響有一定的時間-劑量效應。

圖1 EHP的標準曲線Fig.1 Standard curve of EHP

圖2 氨氮腔迫對凡納濱對蝦EHP感染率的影響Fig.2 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP infection rate of L.vannamei

由圖3可知，試驗結束時，各組凡納濱對蝦的存活率從大到小依次為試驗組Ⅱ、空白組、試驗組Ⅰ，表明試驗組Ⅱ凡納濱對蝦的健康狀況優于試驗組Ⅰ和空白組。

圖3 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦存活率的影響Fig.3 Effects of ammonia nitrogen stress on survival rate of L.vannamei infected with EHP

2.3不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦體長和體重的影響從圖4可以看出，各組凡納濱對蝦的體長變化趨勢基本一致，呈現單調遞增的趨勢，表明9.0 mg/L氨氮對感染EHP凡納濱對蝦的體長增長有一定的促進作用。

從圖5可以看出，各組凡納濱對蝦的體重變化趨勢基本一致，呈現單調遞增的趨勢，表明9.0 mg/L氨氮對感染EHP凡納濱對蝦的體重增長有一定的促進作用。

圖4 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體長的影響Fig.4 Effects of ammonia nitrogen stress on body length of L.vannamei infected with EHP

圖5 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體重的影響Fig.5 Effects of ammonia nitrogen stress on body weight of L.vannamei infected with EHP

由表1可知，試驗結束后，空白組大蝦增長率為9.17%，試驗組Ⅰ的大蝦增長率為19.29%，試驗組Ⅱ的大蝦增長率最高(22.65%)，且小蝦所占的比例下降明顯。

表1 0 d和30 d各組不同大小凡納濱對蝦所占比例

2.4不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦EHP攜帶量的影響從圖6可以看出，各組EHP攜帶量的變化趨勢基本一致，呈現單調遞增的趨勢，0～10 d 3組EHP攜帶量差異不大，10～30 d空白組EHP攜帶量最高，表明試驗組Ⅱ抑制EHP表達的效果優于空白組和試驗組Ⅰ。

3 討論

在養殖水體中，氨氮作為重要的水質因子之一，主要以NH3和NH4+2種形式存在，其中NH3對水生動物的損傷最嚴重，NH3不帶電荷可以穿透水生動物體表進入體內，破壞水生動物的生理機能，能夠對其組織器官造成損傷，引發甲殼動物急性中毒癥狀，對水生動物的健康生長有著重要的影響[22-25]。肝胰腺作為重要的新陳代謝和解毒器官，是對蝦在氨氮脅迫下表現最敏感的器官[26]。研究表明，氨氮脅迫會降低蝦類的免疫力，增加對病原體的感染率[27-28]。

圖6 氨氮脅迫對凡納濱對蝦EHP攜帶量的影響Fig.6 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP carrying capacity of L.vannamei

EHP作為對蝦養殖中重要的病原之一，主要侵染對蝦的肝胰腺和腸道，能夠從宿主細胞獲得能量，影響對蝦的生長發育。該試驗研究了不同濃度氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體重和體長的影響，結果表明試驗組Ⅱ凡納濱對蝦體重和體長的增長情況優于試驗組Ⅰ和空白組，而試驗組Ⅱ凡納濱對蝦的EHP攜帶量最少。研究表明，EHP的攜帶量與對蝦的體重和體長等指標有一定的相關性，呈現負相關性[29-30]；氨氮脅迫影響蝦類的生長發育，而肝胰腺是受到損害最主要的器官[31]，與EHP侵染的是同一器官。由于EHP進化過程中沒有合成ATP 的功能[32]，所以其生長繁殖和能量代謝只能利用宿主細胞的ATP，從而影響宿主的能量代謝[33]。氨氮損傷肝胰腺引起其合成ATP功能減弱，EHP在肝胰腺細胞中得不到足夠的能量，從而抑制自身的生長甚至死亡，導致凡納濱對蝦EHP攜帶量減少，延緩EHP的感染率以及提高對蝦的存活率。該試驗結果表明當氨氮濃度為9.0 mg/L時，凡納濱對蝦的生長狀況優于其他2組，EHP攜帶量少于其他2組，個體較大的凡納濱對蝦 EHP 攜帶量明顯低于較小的個體[33]，EHP感染率及存活率也低于其他2組，空白組和試驗組Ⅰ除了存活率有明顯差異外，其他指標均無明顯差異。這說明氨氮在一定濃度范圍內可以有效控制EHP的攜帶量，即當養殖水體氨氮濃度為6.0～9.0 mg/L時，可以有效減少凡納濱對蝦EHP 的攜帶量，從而為對凡納濱對蝦的養殖提供重要的指導意義。