西北高海拔地區放養偶蹄類動物腸道微生物多樣性的宏基因組比較研究

尚立強，薛世魁，王惜婧，張小麗*

(1.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省蘭州市城關區動物衛生監督所，甘肅蘭州 730030)

宏基因組學(metagenomics)是一種以新一代高通量測序技術為基礎，以特定環境下微生物群體基因組為研究對象，分析微生物群體的多樣性、種群結構、進化關系、功能活性、相互協作關系及其與環境的關系，發掘潛在的生物學意義。與傳統微生物研究方法相比，宏基因組測序技術規避了絕大部分微生物不能培養、痕量菌無法檢測的缺點，可從基因層面對整個微生物群落進行分析，并可使序列結果分析的速度與準確性都大大提高[1]。目前，該技術已被成功應用于研究污水、植物、動物及人體等多種環境中微生物的多樣性[2-5]。通過宏基因組測序分析技術不僅可以明確宿主與微生物之間的相互關系，提高宿主的健康狀態和營養水平，而且可以增加對宿主胃腸道微生物代謝通路的了解。近年來，關于動物腸道微生態的研究受到人們廣泛關注，研究動物腸道微生物不僅可以描述動物腸道微生物的系統發育，分析其腸道菌群功能，了解其胃腸道微生物區系的變化規律、信號通路及其響應機制，而且可以通過改變腸道微生物組成、增加優勢菌群數量等有效措施預防和治療某些腸道疾病，進而為動物健康、可持續的繁殖和生存做出貢獻，同時也為研究動物生存環境的微生物多樣性提供了相關數據[6-7]。

武威市地處我國西北地區，位于101°49′～104°16′E，36°29′～39°27′N，擁有南部祁連山山地、中部走廊平原和北部荒漠3個地貌單元，海拔介于1 020～4 874 m。雙峰駱駝、綿羊及白牦牛是這一地區主要放養的經濟動物。其中，天祝白牦牛是我國稀有而珍貴的地方牦牛類群，是經過長期自然選育和人工選育而成的特有畜種，已被列入國家級畜禽保護品種，其腸道微生物的多樣性具有很強的地域代表性。通過研究這些動物腸道微生物的多樣性，可為進一步了解我國西北高海拔地區特有的環境微生物多樣性提供參考依據。筆者采集了這3種動物的糞便樣品并提取其總DNA，通過宏基因組denovo測序和生物信息學分析，闡明并比較了這些動物腸道微生物的多樣性，并對其群落功能進行了分析。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器瓊脂糖、PBS、抗生素、TaqMaster Mix、DNA Marker 2000，均購自上海生工生物工程技術有限公司；NanoDrop2000購自Thermo Scientific公司。

1.2糞便樣品采集從甘肅省武威市采集新鮮的雙峰駱駝、綿羊及白牦牛糞便樣品各15份。樣品采集時避開外部雜菌污染區對中部的糞便樣品進行無菌采集后儲存于冰盒中，立即送至實驗室進行處理。

1.3DNA提取及檢測利用QIAamp DNA Stool Mini Kit對樣品總DNA進行提取，所有操作按照試劑盒提供的操作說明書進行。DNA提取完畢后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對抽提的基因組DNA完整性進行了檢測。同時，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，USA)和TBS-380微型熒光計(Promega，USA)對抽提DNA樣品的純度和濃度分別進行了測定。條帶單一或稍有彌散，無色素、RNA、蛋白等雜質污染，總量滿足2次建庫需求的DNA樣品方可進行后續測序分析。

1.4上機文庫構建及測序檢測合格的DNA樣品由美吉生物公司進行文庫構建及測序。利用Covaris M220超聲發生器將合格的DNA樣品打斷成300 bp左右的片段，然后使用TruSeq Nano DNA Sample Preparation Kits選擇性回收目的片段并在兩端連接接頭，以構建測序文庫。文庫建好后，使用Illumina Hiseq2500平臺進行雙末端測序，測序得到的下機數據(也稱為原始數據RawData)用于后續的生物信息分析。

1.5序列處理及生物信息學分析為了提高后續分析質量和可靠性，首先對原始序列進行了拆分、質量剪切以及去除污染等優化處理。使用軟件Seqprep(https：//github.com/jstjohn/SeqPrep)去除含N堿基的reads，對序列3’端和5’端進行質量剪切，然后使用軟件Sickle(https：//github.com/najoshi/sickle)去除剪切后長度小于50 bp及平均質量值低于20的reads，保留高質量的pair-end reads和single-end reads，最后通過BWA軟件(http：//bio-bwa.sourceforge.net)將reads比對宿主DNA序列，去除與宿主基因組相似性高的污染reads。將優化處理后的序列使用拼接軟件SOAPdenovo(http：//soap.genomics.org.cn/，Version 1.06)進行拼接組裝。拼接主要參數k-mer值設范圍為39～47。在scaffolds內部gap處，將scaffolds打斷成新的contigs，并對大于等于500 bp的contigs進行統計，從中選擇最優組裝結果。使用MetaGene(http：//metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)對拼接結果中的contig進行基因預測。

然后，對獲得的基因序列進行物種相對豐度和功能上的分類及注釋。使用BLASTP程序(BLAST Version 2.2.28+，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列分別與eggNOG數據庫(http：//eggnog.embl.de/)和KEGG 數據庫( http：//www.genome.jp/kegg/)進行比對(e值為1e-5)，進而獲得詳細的物種注釋。此外，在上述分析的基礎上，進行了相似聚類，分組排序、差異比較等多方向的統計分析和探索，并對結果進行了可視化展示，挖掘數據中的有效信息。

2 結果與分析

2.1門水平上不同動物腸道微生物的比較該研究對雙峰駱駝、綿羊和白牦牛的糞便樣品進行了宏基因組學分析，每個樣本平均產生15 Gbp的測序數據。分類學分析結果顯示，在門水平上雙峰駱駝、綿羊和白牦牛的腸道微生物群落主要分布于以下7個優勢菌門(占比大于1%)，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和廣古菌門(Euryarchaeota)。其中Bacteroidetes在3種動物腸道中相對豐度都是最高的(駱駝64.61%，綿羊63.95%，白牦牛77.09%)，其次是Firmicutes(駱駝21.53%，綿羊7.54%，白牦牛12.48%)。這表明草食動物在腸道微生物多樣性上存在一致性。其余5個優勢門類在3種動物中的相對豐度各不相同(圖1a)。Fibrobacteres在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為3.41%、7.54%和0.08%；Proteobacteria在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為2.48%、4.71%和4.15%；Spirochaetes在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為0.68%、5.03%和0.68%；Verrucomicrobia在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為1.96%、1.41%和2.41%；Euryarchaeota在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為0.15%、1.60%和1.60%。

圖1 門(a)和屬(b)水平上不同動物腸道微生物的比較 Fig.1 Comparison of intestinal microbe among different animals at phylum(a) and genus(b) levels

2.2屬水平上不同動物腸道微生物的比較在屬水平上，3種動物的腸道微生物群落主要分布于以下4個優勢屬(占比大于10%)，包括擬桿菌屬(Bacaeroides)、Alistipes、普氏菌屬(Prevotella)和 纖維桿菌屬(Fibrobacter)，其中Bacteroides在3種動物腸道中的相對豐度都是最高的(駱駝28.09%，綿羊22.62，白牦牛31.43%)(圖1b)。利用韋恩圖展示3種動物各自特有和共有細菌物種數目，結果顯示這3種動物的腸道微生物種類在分類學水平屬上存在高度的相似性(圖2)。駱駝、綿羊和白牦牛腸道中所鑒定到的總的屬數目分別為1 393、1 223和1 404個，而其中3種動物所共有的屬數目多達1 067個，說明這一地區的環境微生物群落具有一定的穩定性。

2.3COG功能分析為了調查3種不同動物之間的腸道微生物基因功能差異，將基因集序列與eggNOG 數據庫進行比對(e值為1e-5)獲得基因對應的COG(Clusters of orthologous groupsof proteins)，然后使用COG對應的基因豐度總和計算該COG的豐度。結果顯示，3種動物都有20個 functional COG categories 被檢測到，而且它們之間的豐度存在高度的相似性(圖3)。

圖2 不同動物腸道微生物種類的比較 Fig.2 Comparison of intestinal microbe populations in different animals

3種基因組中存在大量的高質量序列并未匹配到以上任何屬中，這些序列沒有與任何生物類群匹配，意味著這些序列與當前生物信息數據庫中任何已知生物的序列沒有相關性或者這些序列與它們的親緣關系非常遠。因此，這3種動物腸道中蘊藏著驚人的生物多樣性。

為進一步了解不同動物之間的差異，根據COG之間的相似度關系，得到聚類后的菌群相對豐度比較熱圖。從圖4可以看出，3種動物間COG具有較高的相似性。

2.4KEGG功能注釋利用BLAST將基因集序列與KEGG 的基因數據庫(GENES)進行比對，將比對結果使用KOBAS 2.0軟件進行功能注釋。使用KO、Pathway、EC、Module 對應的基因豐度總和計算該功能類別的豐度。結果發現，駱駝、綿羊及白牦牛這3種動物腸道菌群可能參與的代謝通路分別為311、199及305個，涉及到各個方面，包括脂肪酸的代謝、多糖的代謝、蛋白酶以及肽酶的產生等。同時，3種動物共同所涉及的代謝通路有188條，因此3種動物腸道菌群所涉及的功能具有較高的相似性。

圖3 不同動物腸道微生物種類的比較Fig.3 Comparison of intestinal microbe species in different animals

圖4 不同動物腸道段及糞便腸道微生物屬比較熱圖Fig.4 Heatmap analysis of COGs of genes in the intestinal segments and fecal intestinal microflora of different animals

3 討論

已有的動物腸道微生物研究顯示不同動物之間在腸道微生物多樣性方面有明顯差異。此外，環境在很大程度上影響動物腸道微生物多樣性[8]。該研究結果也表明，駱駝、綿羊及白牦牛這3種動物腸道菌群是不同的，但由于其生存環境的一致性導致其腸道段微生物的種類和分布具有高度的相似性，這與以前的研究報道相一致。

不同動物的腸道段微生物的種類和分布特點和規律不同，在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和廣古菌門(Euryarchaeota)等菌門為優勢菌門，而在在屬水平上擬桿菌屬(Bacaeroides)、Alistipes、普氏菌屬(Prevotella)和 纖維桿菌屬(Fibrobacter)等菌屬為優勢菌屬，具有明顯的差異。此外，差異微生物所富集的代謝通路在不同動物中是不同的，主要差異在物質代謝和傳染性疾病相關通路，但仍具有高度的相似性。

我國西部高海拔地區物種分布廣泛、種類眾多，該研究結果可為了解我國西部高海拔地區的微生物多樣性，特別是我國所特有的白牦牛等動物的腸道微生物多樣性提供重要信息。