人參皂甙Rb1通過調控縫隙連接蛋白40治療腦缺血再灌注損傷的機制

施 虹， 任大斌， 鄭 平， 童武松， 馮九庚， 段 劍， 陳 偉

腦缺血再灌注損傷(I/R)所帶來的致死及致殘率仍然較高[1]，目前臨床上缺乏明確有效的治療手段。人參皂甙(GS)是人參中最主要的活性物質，已經被證明對神經損傷類疾病有著明顯的保護作用[2]。GS-Rb1已被證明是GS中最主要的成份。我們的前期研究顯示：GS-Rb1的腦保護作用可能和下調縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)40有關[3]，但尚未進一步證明相關的分子機制。本研究通過缺血再灌注損傷后調控PKA途徑，觀察PKA途徑參與GS-Rb1下調Cx40表達的相關性，旨在探討GS-Rb1對腦I/R損傷保護作用的具體機制及可能涉及多信號分子信號傳導途徑，為腦缺再灌注損傷的分子水平的治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 100只3月齡、體重350～450 g的雄性SD大鼠購置于上海畢凱實驗動物有限責任公司(滬ICP備05033115)苯巴比妥麻醉鈉購置Fluka公司(德國)。GS-Rb1(純度大于99%)購自上海邦景(中國)，H-89(純度大于99%)購自上海RBI生物(中國)，兔抗大鼠Cx40一抗購自Santa Cruz(美國)，兔抗大鼠GAPDH一抗購自Abcam(英國)，辣根酶標記二抗均購自Abcam (英國)，化學發光試劑盒購自中山金橋生物科技(中國)，所有ELFA、ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物(中國)，激光多普勒血流儀購自Stockholm(瑞典)，蛋白電泳儀購自Bio-Rad(美國)，NAPDH氧化酶活性試劑盒購自Beyotime (中國)，M200Pro免疫酶標儀購自TECAN(奧地利)。

1.2 動物模型制作 實驗用大鼠在通風房間內按照光照：黑暗時間比例為12∶12 h，給予水和食物適應性喂養1 w，動物倫理已得到上海市浦東新區人民醫院實驗動物倫理委員會的同意。按照夾閉法建立大鼠缺血模型：將3%戊巴比妥以65 mg/kg的濃度給予大鼠麻醉后，以頸部正中切口進入，找到雙側頸總動脈，分離血管外膜及迷走神經，用微血管夾將雙側頸總動脈夾閉，整個手術過程用動物實驗專用體溫裝置把動物體溫維持的37 ℃攝氏度。夾閉效果用激光多普勒血流儀進行測量(以小于正常血流量的25%作為有效)。阻斷雙側頸總動脈血流30 min后，撤去血管夾，恢復血流，產生再灌注(以血流量恢復至基線水平75%視為有效)。

1.3 藥物的干預及分組 100只SD大鼠被隨機分為①假手術(sham)組、②灌注后GS-Rb1(I/R+GS-Rb1)治療組、③灌注后GS-Rb+H-89阻斷(I/R+GS-Rb1+H-89)組、④溶媒(I/R+DMSO)組及⑤損傷(I/R)組，每組20只。①僅暴露而不夾閉頸總動脈，②③均采用夾閉頸總動脈法制作腦I/R模型，1 h后腹腔注射GS-Rb1及GS-Rb1+H-89，④為I/R形成1 h后腹腔注射DMSO，而⑤則是I/R形成后不給予處理，所有組實驗時間均設定為I/R后8 h。每組取10動物行行為學檢測和腦組織含水量測定，另10只動物則行蛋白學檢測。根據我們之前預實驗及前期實驗顯示，為獲得P值在0.05水平，1-beta在0.20水平，根據Effect-Size計算出所需要的每組動物數量為8(G-Power3.0)。在本實驗中，我們預定每組10只動物，以防動物意外死亡引起樣本量的不足。根據腦缺血再灌注損傷的病理生理特點及我們前期的研究經驗，設定在再灌注后8 h，以拉頸法處死動物。

1.4 大鼠NSS評分 采用雙盲法，根據以下原則：(1)提鼠尾離地面約1尺，觀察前肢情況。正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面。有左肩內旋，左前肢內收者，評為4分，否則0分。(2)將動物置平滑地板上，分別推左(或右)肩向對側移動，檢查抵抗運動的阻力。正常大鼠兩側阻力明顯對稱。右肩向左側移動時，發現阻力下降時，根據下降程度的不同，評為1～3分；(3)將動物兩前肢置一金屬網上，觀察兩前肢的張力，正常大鼠兩前肢的張力明顯對稱，發現左前肢肌張力下降者，根據下降的輕重，評為0～3分。根據以上評分，滿分10分，分數越高，說明動物的行為障礙越嚴重。

1.5 腦含水量測定 我們采用Hatashita的干濕重法測定腦含水量的變化。將完成NSS的實驗動物處死，快速開顱取出大腦，并移到冰面，并測定大腦的濕重。再將動物大腦放入蒸箱中，在110 ℃，烘蒸24 h，測得大腦干重的量。含水率為(濕重大腦-干重大腦)/濕重大腦*100%。

1.6 免疫蛋白印記(WB)實驗 將海馬區域的皮質組織標本收集，并置入試管中，用冰冷的PBS洗滌兩次；加入RIPA裂解緩沖液(Santa Cruze)，含1%的蛋白酶抑制劑混合物。冰上勻漿、裂解10 min，低溫離心12000 r/min，15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白，經12%的SDS-PAGE Gel電泳分離，常規方法轉印至硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂牛奶-TBST封閉2 h，再分別將Cx40(1∶1000)、GAPDH(1∶2000)一抗加入封閉液，4攝氏度輕搖過夜，回收一抗液體，給予TBST溶液洗滌NC膜，加入辣根酶標記山羊抗兔二抗抗體與封閉液按1∶2000的比例混合液，37 ℃，孵育1 h，再采用化學發光試劑盒進行發光顯影。采用Image J 1.36b軟件下行吸光度分析，蛋白吸光度值/GAPDH為相對含量，以Sham組目標蛋白/GAPDH為100%，其余組與之進行比較。

1.7 ELFA檢測氧化應激因子NAPDH氧化酶活性 自腦分離出海馬的皮質組織，在冰上PBS中充分勻漿，以4 ℃，12000 r/min，10 min離心，取上清液，置入96孔熒光板中，再加入80 μlPBS及6.25 μl的1 mol/L的光澤精，再加入100 μmol/L的NAPDH后開始發生反應。采用多功能酶標儀，在吸收波長340 nm，檢測速度30 s，時間為5 min。

1.8 ELISA法炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的測定 采用第1.7部分的標本，按照炎性因子各自的ELISA免疫試劑盒的操作說明進行操作。

2 結 果

2.1 神經損傷嚴重度評分(Neurological Severity Score，NSS) GS-Rb1治療組盡管較假手術組0分明顯升高(P<0.05)，但相對于溶媒組及損傷組卻明顯降低(P<0.05)，具有治療效應。采用H-89后，此種效應可被明顯抑制(P<0.05)(見圖1)。

2.2 腦含水量的測定 腦水腫含量測定結果表明，GS-Rb1治療后，腦水腫程度較溶媒組及損傷組明顯緩解(P<0.05)，且與假手術組無明顯差異(P>0.05)。但H-89可明顯降低GS-Rb1的此種腦保護效應(P<0.05)(見圖2)。

2.3 蛋白學檢測Cx40在GS-Rb1及GS-Rb1+H-89單獨及聯合作用下表達的變化 在給予GS-Rb1治療后，Cx40蛋白表達盡管較假手術組升高，但較溶媒組及損傷組明確下降，而H-89則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(見圖3)。

2.4 氧化應激因子NAPDH氧化酶(NAPDH oxidase activity)活性測定 GS-Rb1可明顯下調損傷后神經元NAPDH氧化酶的活性(P<0.05)，且與假手術組相比亦無明顯差異(P>0.05)，但是此種效應可被H-89明顯的抑制(P<0.05)(見圖4)。

2.5 ELISA檢測海馬區神經元氧化應激因子炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-a等炎性因子蛋白的表達 GS-Rb1治療組較阻斷組可明顯降低IL-1β、IL-6及TNF-a表達(P<0.05)，但給予H-89后，則可明顯抑制GS-Rb1的此種效應(P<0.05)(與假手術組比較*P<0.05；與GS-Rb1保護組比較#P<0.05)(見圖5)。

各實驗組與假手術(Sham)組比較*P<0.05，I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較#P<0.05

圖1 NSS評分的變化(n=10)

各實驗組與假手術(Sham)組比較*P<0.05，I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較#P<0.05

圖2 腦含水量的變化(n=10)

各實驗組與假手術(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖3 Cx40相對含量的表達(n=10)

各實驗組與假手術(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖4 NAPDH oxidase activity的變化(n=10)

A. IL-1β；B. IL-6；C. TNF-α各實驗組與假手術(Sham)組比較*P<0.05，# I/R8 h+GS-Rb1組與/R8 h+GS-Rb1+H-89組比較P<0.05

圖5 炎性因子的含量的變化(n=10)

3 討 論

人參已經被廣泛的作為藥物、保健及飲食之用。人參皂甙(GS)已被證明是人參的最主要的活性成分。目前大量實驗證明：GS具有抗炎、抗氧化及降低脂質類代謝產物的作用[4]。Rb1作為GS中含量最為主要的成分，得到越來越多的重視。目前已證實GS-Rb1能維持腦血屏障的完整，在腦缺血后治療中起著明顯腦保護作用。我們的前期研究發現：GS-Rb1可抑制氧化應激因子NOX1、NOX2、NOX4、NAPDH及炎癥因子IL-1β，并上調細胞骨架蛋白ZO-1、Occludin的表達，具有神經功能保護作用[5]。但以上的研究尚未對GS-Rb1參與調節的損傷因子的具體方式和機制進行進一步分析，因此我們在本項實驗中，我們采用信號傳導通路的調節，來進一步觀察GS-Rb1對上述產物的具體作用機制。

縫隙連接(Gap Junction，GJ)為細胞間的直接聯系的方式。GJ可供細胞內的離子、某些小分子信號傳導因子及細胞內容物(<1.2KD)在細胞間進行傳遞[6]。GJ在腦損傷的過程中起著重要的作用，不同類型的GJ對損傷/抗損傷信號具有選擇性，但相關機制仍未完全清楚[7]。目前大量研究認為，Cx43和谷氨酰胺轉移酶、Na-Ka-ATP酶、熱休克蛋白相關性密切，可加強腦損傷性物質的轉運，并減少氧化應激產物的產生[8，9]，Cx43還可與Bcl2結合，緩解細胞凋亡的現象[10]。針對于Cx40蛋白與腦損傷的相關性，來自于動物模型及臨床標本的研究均顯示：腦損傷后Cx40蛋白含量的升高及Cx40與Cx43形成的異型縫隙連接的升高增多與腦損傷程度呈現一致性[11，12]。我們的前期研究還證實，Cx40的增多可能與氧化應激活性的增強密切相關[3]。此外，近年來的研究顯示Cx40與IkBa具有同源性，其異常升高可能與核因子途徑的激活相關[13]。因此，我們推測，Cx40蛋白的異常增多可能是Cx43功能的喪失的一種補償機制，且異常表達Cx40對損傷/抗損傷物質的通過性平衡失調，導致損傷信號的擴大、氧化應激作用增強及核因子途徑活化所致的炎性因子的大量增生，具有腦損傷的效應。同時在我們對上游的信號途徑的篩選研究中發現，ERK1/2通路與Cx40異常增多及Cx43磷酸化的相關性最大，且通過抑制ERK1/2通路，可明顯緩解腦損傷的程度[11]。有文獻指出，在多條不同功能信號傳導通路中存在競爭性抑制的Gatekeeper[14]效應，而PKA途徑可上調Cx43的功能，從而被稱為Cx43功能的Gatekeeper。因此我們推測，腦損傷后ERK1/2途徑的激活可抑制PKA途徑的活性，導致Cx40蛋白異常增多及Cx43蛋白磷酸化升高及縫隙連接功能紊亂可能與腦損傷密切相關。

結合上述的情況，我們認為GS-Rb1腦保護效應可能與PKA途徑的激活、通過Gatekeeper效應抑制ERK1/2途徑的活性從而進一步抑制Cx40升高有關。在我們的此項試驗中，我們采用PKA的特異性抑制劑H-89，觀察其如何影響GS-Rb1在腦損傷后的治療效應，我們發現，H-89能明顯抑制GS-Rb1下調Cx40的功能，同時能抑制GS-Rb1降低氧化應激因子及炎性因子等腦保護作用，并且這些作用均在形態學及行為學上得到了進一步的證實。

綜上所述，我們的此項研究結果進一步明確GS-Rb1參與損傷后腦保護機制與抑制Cx40蛋白表達異常升高有著密切的關系，同時也明確了PKA途徑可能參與了這個過程，從而以期為進一步研究腦缺血再灌注損傷可能的基因靶點治療奠定基礎。