犬乳牙根尖周炎對繼承恒牙發(fā)育影響的實驗研究

高黎 吳妍慧 楊敬一 裴海娟 李聚慧 張彥喜

乳牙根尖周炎是常見的兒童口腔疾病，多由牙髓感染發(fā)展而來，它不僅造成患兒咀嚼能力下降，而且可能導致繼承恒牙發(fā)育及萌出異常。臨床許多文獻報道乳磨牙根尖周炎造成繼承前磨牙的萌出及替換異常[1-5]，也有學者通過建立動物模型觀察到乳牙根尖周炎治療情況及對繼承恒牙萌出時間的影響[6-7]，但很少報道乳前牙根尖周炎對繼承恒牙的影響，對于繼承恒牙超微結構及能譜分析是否異常的研究也未見涉及。本實驗擬建立犬乳前牙根尖周炎模型，觀察乳恒前牙牙齒替換及繼承恒牙的微觀結構和能譜變化。

1 材料與方法

選取6 只40 d齡本地雜交犬，性別不限，隨機將實驗犬51-54 和84作為實驗組，61-64和 74作為對照組，兩組各30 顆。術前6 h禁食、水，使用鹽酸氯胺酮注射液按照4～5 mg/kg的劑量經(jīng)實驗犬腹部肌肉注射。給藥后3～5 min麻醉顯效，主要表現(xiàn)為睜眼凝視及眼球震顫，肢體肌力增強，呈木僵狀態(tài)。麻醉成功后局部注射阿替卡因腎上腺素注射液。固定犬頭部，高速手機開髓，擴大開髓孔，完全暴露髓腔(圖1A)，內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)用0.9%生理鹽水配制成5 mg/ml混懸液過濾除菌后，小棉球蘸LPS液至飽和，隨即將小棉球放入髓腔內(nèi)，調(diào)制氧化鋅丁香油水門汀封閉開髓孔。術后即刻X線片示暫封良好，乳牙根尖未見異常影像，繼承恒牙牙胚均存在，未見發(fā)育異常(圖1B)， 手術時間控制在30 min之內(nèi)。

A： 實驗組犬牙開髓照； B：對照組實驗犬牙封入LPS后根尖片

A： Pulp exposing process of the experimental teeth； B： X-ray photo of the experimental teeth with sealed LPS

Fig 1 Instant image and X-ray image of experimental teeth after applying experimental factors

術后觀察實驗牙齒，相應根尖周黏膜色澤，形態(tài)，質地變化，并進行X線(額定工作電壓220 V，曝光時間0.22 s，間歇式連續(xù)加載運行)檢查。

記錄乳恒牙替換情況，待前恒牙完全萌出，尚未建立咬合時(第210 天)，空氣栓塞法處死動物，取得實驗動物頜骨標本，觀察繼承恒牙發(fā)育情況。

選取實驗組牙齒釉質發(fā)育不全區(qū)及對照組對應區(qū)，制成5 mm×3 mm×2 mm牙釉質塊,放入蒸餾水超聲震蕩洗滌5 min，蒸餾水反復沖洗，放入75%乙醇中。掃描前樣品放入預真空脫水干燥機中脫水干燥,放入真空鍍膜機內(nèi),鍍大約300～400 ?厚的金膜用導電膠粘在樣品臺上之后,用掃描電鏡(JSM-7500F， 日本電子公司)對病變牙釉質表面結構進行觀察并攝像，并用能譜儀分析其元素構成。

2 結 果

2.1 乳牙根尖周炎形成

實驗動物均成活。術后2 周時實驗組乳牙冠顏色及相應根尖區(qū)黏膜未見異常; 3 周時，部分乳牙根尖區(qū)唇側黏膜發(fā)現(xiàn)竇道口(圖2A)， X線片示根尖下方可見低密度暗影區(qū)(圖2B); 4 周時X線片示根尖下方低密度暗影區(qū)面積增大，乳牙髓腔變大，根管壁變薄，根尖部吸收(圖2C)，對照組乳牙牙根無吸收，根尖未見低密度暗影。

2.2 實驗組部分繼承恒牙過早萌出

5 個月齡混合牙列期， 實驗組部分繼承恒牙萌出早于對側對照牙(圖3A); 6 個月齡時部分實驗犬仍處于混合牙列期，乳尖牙未替換，實驗組繼承恒牙萌出早于對側對照牙(圖3B); X線片示實驗組未萌出繼承恒牙胚在頜骨內(nèi)距牙槽嵴頂?shù)奈恢妹黠@高于對照組繼承恒牙胚(圖3C)， 7 月齡時所有實驗犬恒前牙萌出完畢。各個月齡實驗組恒牙早萌率見表1。

A: 實驗犬3 周口內(nèi)照； B: 實驗犬3 周根尖片； C： 實驗犬4 周根尖片

A: The intraoral image of 3-week experimental teeth; B: X-ray photos of 3-week experimental teeth; C： X-ray photos of 4-week experimental teeth

Fig 2 Establishment of the model of deciduous teeth with apical periodontitis in dogs

2.3 繼承恒牙釉質發(fā)育不全

實驗組繼承恒牙有33.3%出現(xiàn)釉質發(fā)育不全(10/30)，其中釉質著色4 例，恒切牙切端和尖牙牙尖唇側釉質呈白堊色不透明斑塊，釉質形態(tài)完好，表面光滑(圖4A)；另有釉質缺損6 例，繼承恒切牙唇、腭面，尖牙牙尖部出現(xiàn)散在的釉質缺損，呈現(xiàn)點窩狀及帶狀凹陷，缺損處有黃色附著物，牙體顏色正常(圖4B、4C)。對照組繼承恒牙無釉質發(fā)育不全。

A: 實驗犬5 月齡口內(nèi)照； B: 實驗犬6 月齡口內(nèi)照； C: 實驗犬7 月齡前牙根尖片

A: The intraoral image of 5-month experimental teeth； B: The intraoral image of 6-month experimental teeth； C: X-ray photos of 7-month experimental teeth

Fig 3 Experimental teeth replacement process from 5 to 7 months of age

A: 實驗犬牙表面釉質斑塊； B、 C: 實驗犬牙表面釉質凹陷，缺損

A: Plaque on experimental teeth enamel surface； B， C: Hollows and defects on experimental teeth enamel surface

Fig 4 Enamel hypoplasia of experimental teeth

2.4 掃描電鏡結果

犬正常牙冠：表層無釉柱釉質呈片狀分布,無明顯釉柱結構(圖5A)，其余部位釉柱晶體按一定方向緊密排列，釉柱橫斷面呈現(xiàn)近似六棱形結構，釉柱排列整齊，釉柱間質均勻，結構清晰(圖5B)。釉質著色區(qū)：牙釉質表面不平，表層釉質缺失，部分釉柱較細， 頭部呈尖筍樣，局部柱間隙加寬(圖5C)，有少量柱間質形成，結構不清晰，大部分柱間質缺如(圖5D)。釉質缺損區(qū)：牙釉質呈現(xiàn)蜂窩狀損害,釉柱中心性破壞, 表層有大小不等的缺損，暴露出下方的牙釉質(圖5E)。缺損周圍牙釉質呈蜂窩狀，但孔周形狀不清晰，不規(guī)則，空隙深淺大小不一(圖5F)。

Tab 2 Ca, P and Ca/P difference in the 2 groups (n=10,

注： Ca， P含量均為重量百分比

2.5 能譜分析

取釉質發(fā)育不全的恒牙病損區(qū)釉質的鈣、磷重量百分比及鈣/磷比值，與對照組恒牙相應區(qū)域的數(shù)值進行比較，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，結果表2示2 組數(shù)據(jù)之間的鈣、磷含量有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組釉質發(fā)育不全區(qū)的鈣、磷含量低于對照組。鈣磷比2 組間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明鈣/磷含量比無明顯差異。

A: ×500； B、 D： ×5 000； C、 E： ×1 000； F： ×2 000

3 討 論

乳牙根尖周炎是兒童口腔臨床中常見的疾病，國內(nèi)外學者采用多種方法建立根尖周炎動物模型以探討其致病機制及對繼承恒牙的影響。用于建立實驗性根尖周炎的常用動物有猴、犬、鼠、小型豬等。猴的牙齒各方面均與人特別相似，屬于首選動物，但其價位較高，而且乳恒牙替換大約8～12 個月，周期較長；鼠只有一副牙齒，僅用于根尖周炎模型建立的研究；小型豬牙齒解剖結構與人類相似，但目前主要用于牙乳頭或牙髓干細胞在形成牙髓牙本質復合體潛能的研究[8]。犬有兩副牙齒，牙齒形態(tài)和乳恒牙替換與人類相似，較易獲得和飼養(yǎng)。建立根尖周炎模型的方法很多，Liu 等[9]將大鼠牙髓暴露，與口腔相通，口內(nèi)的各種細菌直接進入根管，產(chǎn)生根尖周炎癥； CapíK[10]、Katebzadeh等[11]用感染菌斑封閉于犬根管內(nèi)，建立根尖周炎模型；Teixeira等[12]將大鼠開髓后置入LPS棉球并開放于口腔環(huán)境，通過根尖區(qū)X線片及組織病理學改變，證實LPS能迅速有效地誘導大鼠根尖周炎的發(fā)生。開放暴露的方法所形成的根尖周病損更貼近自然情況，但是用于犬時需一個月左右。而犬乳牙牙根穩(wěn)定期只有50 d左右，不適用于本實驗。因此，本實驗選擇LPS誘導犬根尖周炎的方法。犬牙封LPS后3 周時發(fā)現(xiàn)實驗牙唇側黏膜根尖周區(qū)紅腫，發(fā)現(xiàn)竇道口，部分乳牙根尖區(qū)X線片示根尖下方可見低密度暗影區(qū),說明根尖區(qū)已形成膿腫并破壞骨質并突破黏膜。 4 周時X線片示根尖下方低密度暗影區(qū)面積增大，根管壁變薄，根尖部吸收，這與張鷹等[7]應用LPS誘導形成乳牙根尖周炎的研究結果一致，這證明LPS可快速形成犬乳牙根尖周炎。

乳牙及其下方的恒牙胚作為相互依賴不可割的整體，當乳牙根尖周炎波及恒牙胚時，局部的施瓦茨曼反應(Schwartzman's reaction)可通過激活機體免疫反應，免疫細胞聚集，產(chǎn)生細胞因子或激活補體，誘導和釋放炎癥介質，進一步造成根尖周組織的破壞[22-23],甚至累及鄰近的繼承恒牙胚。乳牙的根尖周病變對繼承恒牙胚的影響取決于病變程度及牙胚的發(fā)育階段，早期慢性持續(xù)的乳牙根尖周炎癥可能造成繼承恒牙的成釉細胞水腫受損甚至死亡，致使恒牙出現(xiàn)釉質發(fā)育不全，表現(xiàn)為特納牙[2,24]。特納牙屬于局部因素(乳牙根尖周炎癥)所引起的外源性釉質發(fā)育不全，依據(jù)Silberman等[25]提出的分類，特納牙(Turner's hypoplasia)分為四型： ①釉質著色; ②牙齒異常結合; ③釉質部分缺損; ④以上3 種的混合型。本實驗中乳牙根尖周炎造成的繼承恒牙釉質發(fā)育不全屬于特納牙，發(fā)生率為33.3%(10 例)，其中釉質著色13.3%(4 例)，釉質缺損20%(6 例)，與Warshawsky 等[26]猴乳牙根尖周模型結果相近。本實驗發(fā)現(xiàn)釉質著色和缺損范圍較小，程度較輕，作者推測可能是前恒牙胚位于乳牙腭側，距乳牙根尖距離較遠，同時犬乳恒牙替換期較短，因此，犬乳前牙根尖周炎造成的繼承恒牙釉質發(fā)育不全較臨床乳磨牙引起的前磨牙釉質發(fā)育不全癥狀輕[1,13]。羥基磷灰石晶體作為牙釉質的基本組成成分，其礦化程度與鈣，磷含量緊密相連，文獻認為鈣/磷比值可確定硬組織有無脫礦[27]。由于人類特納牙的離體樣本較難獲得，有關人類特納牙微觀結構及能譜分析其礦化情況的研究鮮有報道，為觀察釉質表面結構，本實驗通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)正常牙釉質表面由成片狀分布無釉柱結構的高度鈣化區(qū)和正常釉柱區(qū)構成，牙釉柱橫斷面呈現(xiàn)近似六棱形結構，釉柱排列整齊，釉柱間質均勻，結構清晰；實驗組變色區(qū)的釉小柱細長，柱間隙增寬；實驗組釉質缺損的表面的無釉柱釉質全部缺損，下方的釉柱柱端凹陷，孔隙大小不同，深淺不一，結構紊亂。本研究能譜分析發(fā)現(xiàn)釉質發(fā)育不全區(qū)鈣、磷含量均值均較正常區(qū)域低，作者推測這可能與釉質發(fā)育不全區(qū)釉柱細小，柱間隙增寬有一定關系。該區(qū)釉柱結構紊亂，羥磷灰石晶體排列不規(guī)則，容易脫礦引起齲病發(fā)生。釉質發(fā)育不全區(qū)鈣磷比無統(tǒng)計學差異，再次證明乳牙根尖周炎引起的繼承恒牙的釉質發(fā)育不全與遺傳性釉質發(fā)育不全有所不同，它主要是影響繼承恒牙釉質數(shù)量的形成，并不影響已形成釉質的鈣化及成熟。

由于物種差異，與人類相比，動物乳恒牙替換周期較短，動物模型不能完全模擬人乳牙根尖周病的真實情況。乳恒牙替換是一個多種因素相互作用的、復雜有序的生理過程。據(jù)文獻報道，因人乳恒牙替換周期較長，乳牙根尖周炎致乳牙早失后，繼承恒牙早萌與乳牙缺失時間有一定關系，當乳牙缺失發(fā)生在繼承恒牙正常萌出時間前1年左右時，繼承恒牙早萌；若時間過早，繼承恒牙則表現(xiàn)為遲萌[28-29]。而乳牙的根尖周病變絕大多數(shù)是由牙髓病或牙髓感染發(fā)展而來，由于乳牙自身的解剖生理因素導致感染易于擴散且持續(xù)時間長，不易局限化。受到病源刺激后，人乳牙根尖周病可以急性爆發(fā)的形式呈現(xiàn)，也可以在機體抵抗力較強或經(jīng)過不徹底的根管治療后逐漸轉為慢性病程。隨著人們口腔健康意識的提高及患兒及時就診率的增加，口腔醫(yī)師可通過制作阻萌器，及時拔除或治療病變?nèi)檠溃约肮潭ㄟ^早萌出松動的恒牙等措施，早期干預以盡可能保存患兒的年輕恒牙。鑒于本實驗的局限性，臨床工作中我們應注意收集相關病例資料以進行下一步有關早萌繼承恒牙發(fā)病率及礦化程度影響的研究。