鈷鉻合金經有機硅季銨鹽浸泡后對白色念珠菌黏附的影響

劉輝明 廉云敏 高嵐 王璞

050000石家莊， 河北醫科大學第二醫院口腔修復科

目前，我國已經進入老齡化社會，臨床上因牙齒缺失需要可摘義齒修復治療的老年患者人數不斷增加。因長期佩戴義齒而引起義齒性口炎的發病率也逐漸增高。鈷鉻合金基托具有硬度高、彈性模量大、制作簡便等優點以及其價格優勢，目前仍廣泛應用于臨床。但由于其不易磨平和拋光，容易積聚細菌而形成菌斑。因此，本實驗擬用有機硅季銨鹽浸泡處理鈷鉻合金以提高其表面的抗黏附性，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

鈷鉻合金(登士柏,美國)；二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(山東愛普化學有限公司)；電熱恒溫干燥箱(101-0S，紹興蘇珀儀器有限公司)；濁度儀(梅里埃公司，法國); 冷熱循環儀( TC-501-F，蘇州威爾實驗用品有限公司) 。

1.2 實驗菌株和培養基

白色念珠菌 ATCC90028(溫州康泰生物科技有限公司)；沙保羅瓊脂固體培養基(溫州康泰生物科技有限公司)；滅菌1640液體培養基(不含酚紅)(Life Technologies，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制作試件 本實驗采用失蠟法制作10 mm×10 mm×1 mm試件。檢查合格后，依次使用200、 360、 400、 600目砂紙逐級對試件的6 個面進行打磨，每個面50 次。然后用滅菌蒸餾水超聲清洗10 min, 而后用95%乙醇超聲清洗10 min(重復2 次)脫脂，最后用滅菌蒸餾水沖洗，吹干，高溫高壓滅菌后備用。

1.3.2 硅烷膜制備 隨機選取144 片滅菌試件分為A～F 6 個不同濃度處理組：A組：1%有機硅季銨鹽溶液；B組：5%有機硅季銨鹽溶液；C組：10%有機硅季銨鹽溶液； D組：30%有機硅季銨鹽溶液； E組：60%有機硅季銨鹽溶液；F組：滅菌蒸餾水，即為對照組。再將各大組隨機分為4 個不同處理時間組，分別為30、 60、 120、 240 min。浸泡處理后，取出試件，漂洗去除試件表面懸浮的溶液，吹干。然后將電熱恒溫干燥箱調至120 ℃恒溫，將處理后的試件放入恒溫干燥箱中60 min固化成膜[1]后，放入無菌24 孔細胞培養板中備用。

1.3.3 菌懸液制備 將白色念珠菌ATCC90028復蘇后，用無菌棉簽挑取菌落，然后用無菌的1640液體培養基稀釋，吹打混勻后，比濁儀調整，配置成1.5×108CFU/ml的菌懸液備用。比濁前，使用無菌的1640液體培養基作空白對照， 調“0”。

1.3.4 抗黏附性實驗 將A～F 6 組試件分別用1 ml菌懸液浸泡， 37 ℃恒溫箱中培養48 h。 取出試件，在滅菌蒸餾水中蕩洗以去除表面未黏附的細菌。再將試件分別放入1 ml無菌1640液體培養基中，置于快速混勻器上振蕩1 min,比濁儀比濁，記錄數據。

1.3.5 抗黏附性長效性實驗 選取30 片滅菌試件，隨機分成G～K 5 組。G～J組用5%有機硅季銨鹽浸泡120 min(抗黏附性實驗得出的最佳處理組合)后， 在120 ℃恒溫干燥箱中固化60 min成膜，K組用滅菌蒸餾水浸泡后干燥。將G～J試件進行冷熱循環實驗，在5 ℃和55 ℃的恒溫水浴中各浸泡30 s， 此為1 次循環，分別進行0、 2 500、 5 000、 10 000 次循環，K組用蒸餾水浸泡處理。5 組實驗所用時間不同，保證實驗同時結束。然后將各組試件放入1 ml菌懸液中，37 ℃恒溫培養48 h， 取出試件， 沖洗后加入1 ml無菌1640液體培養基，置于快速混勻器上振蕩1 min,比濁儀比濁，記錄數據。

1.4 統計分析

采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學分析。抗黏附性實驗采用析因設計的方差分析方法，兩兩組間比較采用S-N-K檢驗；抗黏附性長效性實驗對照組與實驗組間比較采用Dunnett-t法，各實驗組間比較采用S-N-K檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 抗黏附性實驗

對A～F組數據進行分析結果見表1。 對不同處理濃度采用S-N-K檢驗比較結果見表2。 由濃度和時間組合的濁度均值輪廓圖(圖1)顯示：當處理濃度為5%，浸泡時間為120 min時，濁度值最低，為最佳組合。

2.2 抗黏附性長效性實驗

對G～K組數據進行正態性和方差齊性檢驗，服從正態分布，方差齊(P>0.1)， 使用Dunnett-t檢驗和S-N-K檢驗分析(表3～4)， 除了G組和H組之間無差異外，其余任意2 組之間均有差異(P<0.05)。由此可見，冷熱循環次數對鈷鉻合金表面抗黏附性有影響， 由冷熱循環次數濁度均值輪廓圖(圖2)可見，隨著冷熱循環次數增加，鈷鉻合金表面抗黏附性有所減弱。但是，冷熱循環10 000 次后，鈷鉻合金表面仍具有抗黏附性。

表1 析因設計方差分析

表2 不同濃度S-N-K檢驗 (n=24)

圖1 濃度和時間組合的濁度均值輪廓圖

(I)循環次數(次)(J)循環次數 (I～J)Sig.0對照組-0.4530.0002 500對照組-0.4200.0005 000對照組-0.3150.00010 000對照組-0.2380.000

表4 不同循環次數S-N-K檢驗 (n=6)

圖2 冷熱循環次數濁度均值輪廓圖

3 討 論

由于患者佩戴義齒后，可摘義齒基托與黏膜之間形成了新的滯留區，滯留區內唾液流速減慢，流量減少，導致可摘義齒基托組織面菌斑數增多，菌斑及其產物是造成義齒性口炎的主要因素[2]。白色念珠菌是義齒性口炎的主要致病菌，Fenlon等[3]通過采集標本培養發現，炎癥越明顯者，義齒組織面的白色念珠菌陽性率越高，證明了義齒性口炎的發生與白色念珠菌感染密切相關。

季銨鹽是一種陽離子表面活性劑，由烴基取代銨離子中4 個氫原子而生成的化合物，李佳等[4]通過實驗證明經過季銨鹽類溶液苯扎氯銨浸泡處理的純鈦具有抗菌性。而有機硅季銨鹽是一種新型的季銨鹽抗菌劑，是將硅氧烷引入季銨鹽結構中而制得。其經過水解產生硅醇基(Si-OH)與金屬(Me)結合形成一層Me-O-Si-致密的保護膜的同時，硅醇基之間脫水縮合又生成硅氧硅鍵(Si-O-Si)，從而極大的提高金屬的表面性能。不僅如此，有機硅季銨鹽以有機硅為媒介，使具有殺菌性能的銨陽離子基團吸附于細菌表面，穿透細胞壁，改變細胞壁的通透性，使細胞內物質如DNA、RNA等泄漏，導致菌體死亡[5-6]，即發生“接觸死亡”。Nikawa等[7]利用有機硅季銨鹽浸泡純鈦，研究證實其通過Ti-O-Si共價鍵定植在金屬表面，抑制了白色念珠菌和變形鏈球菌附著和生長，而且通過細胞毒性測試，證明其無明顯細胞毒性。這也為本實驗利用有機硅季銨鹽浸泡處理鈷鉻合金提供依據。

口腔內的溫度會隨著進食，喝水，甚至呼吸而發生變化。冷熱循環實驗則是通過在體外模擬口腔中的溫度變化，加速材料老化的實驗。根據國際標準組織ISO/TS11405: 2015闡述，要求進行500 次循環。然而有學者[8]統計1998～2013 年193 個相關實驗中，只有23 個實驗嚴格按照ISO的標準，其余大多數實驗的循環次數各不相同。 Stewardson等[9]認為500 次循環僅相當于口內不足2 個月的時間。而Gale等[10]假設每天發生20～50 次的冷熱循環， 10 000 次冷熱循環大約相當于臨床使用一年的時間。這一觀點被許多學者所接受。本實驗進行冷熱循環發現，經過10 000 次冷熱循環后鈷鉻合金表面硅烷膜仍具有抗黏附性。因此認為，鈷鉻合金經過有機硅季銨鹽浸泡處理后，其表面硅烷膜的抗黏附性可以保持1 年時間。

口腔內的微生態環境非常復雜，實驗無法完全模擬口腔內環境和患者日常使用情況。所以，義齒在佩戴使用過程中唾液的沖刷作用、食物的摩擦和機械性清潔等對鈷鉻合金表面硅烷膜抗黏附性能的影響有待進一步研究。雖然，體外研究不能完全模擬臨床使用情況，但是本實驗的數據仍然可以為臨床使用有機硅季銨鹽提高鈷鉻合金表面的抗黏附性提供參考。

4 結 論

本實驗條件下鈷鉻合金經過有機硅季銨鹽浸泡處理后，對白色念珠菌具有長效抗黏附作用。